• Título:  ANALISIS FUNCIONAL DE LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTITUMORAL A PARTIR DE CULTIVOS Y CELULARES SOMETIDOS A ELICITACIÓN.
• Autor:  ALMAGRO ROMERO, Lorena
• Universidad:  Universidad de Murcia
• Departamento:  Biología vegetal
• Fecha de Lectura:  22/07/2011
• Mención Europeo / Mención Internacional: concedido
• Programa de doctorado:  PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA
• Dirección: 
  • Pedreño Garcia, Maria Angeles (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • Balagué , Claudine (PRESIDENTE)
  • FERRER AYALA, MARIA DE LOS ANGELES (SECRETARIO)
  • Martínez Zapater, José Miguel (VOCAL)
  • ORTUÑO TOMAS, ANA MARIA (VOCAL)
  • PALAZÓN BARANDELA, JAVIER (VOCAL)
• Descriptores: 
  • CULTIVO CELULAR
  • FISIOLOGIA VEGETAL
  • BIOTECNOLOGIA DE PRODUCTOS NATURALES
• Resumen:
  Los metabolitos secundarios son compuestos químicos de bajo peso molecular que intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta y su ambiente ya que están involucrados en la defensa contra herbívoros, microbios, virus o frente a otras plantas y pueden actuar como moléculas señal para atraer polinizadores o para la dispersión de semillas. Además de la importancia para la propia planta, los metabolitos secundarios se consideran de gran interés para los seres humanos ya que se utilizan, como saborizantes, para la elaboración de fragancias, colorantes y pesticidas y quizás la aplicación más relevante, como principios activos de productos farmacéuticos. Catharanthus roseus (L) G. Don es una planta que pertenece a la familia de las Apocináceas y es comúnmente conocida como Vinca major. Actualmente esta establecida en casi todas las regiones tropicales y subtropicales de la Tierra y se cultiva industrialmente para obtener, a partir de sus hojas, los alcaloides anticancerígenos vincristina y vinblastina mientras que las raíces se utilizan como materia prima para la extracción de alcaloides indólicos monoterpénicos (AIMs) como serpentina y ajmalicina utilizados por su efecto hipotensor. La biosíntesis de los AIMs producidos por C. roseus es extremadamente compleja y requiere de la unión de dos vías metabólicas: la vía indólica y la vía terpénica. La enzima triptófano descarboxilasa (TDC) cataliza la conversión de L-triptófano a L-triptamina mientras que la secologanina se biosintetiza a partir de la ruta del mevalonato. El primer paso de regulación de su biosíntesis se encuentra a nivel de la oxigenación del geraniol en una reacción catalizada por la enzima geraniol-10-hidroxilasa (G10H) y finalmente la secologanina sintasa (SLS) cataliza la reacción desde loganina a secologagina. La triptamina y la secologanina se condensan para formar la estrictosidina, un glucoalcaloide precursor de todos los alcaloides aislados de C. roseus. La enzima que cataliza la condensación de triptamina y de secologanina es la estrictosidina sintasa (STR). La estrictosidina es desglucosilada por la estrictosidina ?-D-glucohidrolasa (SGD) para formar finalmente la estrictosidina aglicona, precursora de los más de 200 alcaloides indólicos biosintetizados por C. roseus. La estrictosidina aglicona se convierte de forma espontánea en dehidrogeisochicina, la cual puede transformarse en catenamina, precursora directa de la ajmalicina y la serpentina. Además, la dehidrogeisochicina puede también transformarse en catarantina y tabersonina aunque no se conoce nada acerca de la naturaleza de las enzimas involucradas en su biosíntesis. La biosíntesis de vindolina a partir de la tabersonina consta de seis pasos enzimáticos catalizados por la tabersonina 16-hidroxilasa (T16H), 16-hidroxi-tabersonina-O-metiltransferasa (16OMT), la 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-tabersoninaN-metiltransferasa (NMT), la desacetoxivindolina 4-hidroxilasa (D4H) y deacetilvindolina 4-O-acetil-transferasa (DAT) (Schäfer y Wink, 2009). De esta manera, a partir de la tabersonina se forma la 16-hidroxitabersonina por acción de T16H la cual será metilada por 16OMT para dar 16-metoxitabersonina. A continuación, la 16-metoxitabersonina se hidroliza para formar la 16-metoxi-2,3-dihidroxitabersonina que se transforma en desacetoxivindolina por NMT. Sobre la desacetoxivindolina actúa D4H para producir la deacetilvindolina que será transformada por DAT a vindolina. La biosíntesis de los alcaloides diméricos se inicia con la condensación de la catarantina y la vindolina, para formar la 3',4'-anhidrovinblastina, precursora de la vinblastina y la vincristina. Vitis vinifera es una planta que pertenece al orden Vitales y su única familia es Vitaceae. Los frutos de la vid y los productos derivados de los mismos constituyen la principal fuente de estilbenos disponibles en la naturaleza. Los estilbenos son compuestos fenólicos de bajo peso molecular localizados de forma específica en los tejidos no lignificados de las plantas, como fitoalexinas y de forma genérica en los tejidos lignificados, como compuestos constitutivos de estos tejidos. Los estilbenos sintetizados en plantas de la familia Vitaceae se denominan viniferinas. La estructura química de las viniferinas se basa en el esqueleto de un hidroxiestilbeno, concretamente el 3,5,4' trihidroxiestilbeno (trans-resveratrol). El trans-resveratrol tiene efectos beneficiosos para las plantas ya que presenta actividad antifúngica y antimicrobiana, además tiene numerosas propiedades saludables para el ser humano entre las que destaca: su actividad anti-hiperoxidativa (anti-envejecimiento), actividad quimio-preventiva contra el cáncer, actividad vasodilatadora y anti-agregación plaquetaria, actividad anti-hepatotóxica y actividad reguladora de trialcilglicéridos. El trans-resveratrol se sintetiza a partir de una unidad fenilpropanoide activada en forma de acetil-CoA y tres unidades de malonil-CoA. El primer paso en la biosíntesis del fenilpropanoide es la desaminación de una molécula de L-fenilalanina para producir el ácido cinámico en una reacción catalizada por la enzima fenilalanina amonioliasa (PAL). El ácido cinámico es hidroxilado en la posición 4 por una cinamato-4-hidroxilasa (C4H) para producir el ácido p-hidroxicinámico que es activado por una 4-cumaril-CoA ligasa (4CL) que produce 4-cumaril-CoA. Una policétido sintasa añade entonces, secuencialmente, tres residuos de acetato para elongar la cadena lateral de la única molécula iniciadora, 4-cumaril-CoA. Dependiendo de la actividad policétido sintasa utilizada por el organismo, se producirá una chalcona precursora de flavonoides, o un estilbeno por la actuación de las enzimas chalcona sintasa (CHS) y estilbeno sintasa (STS), que producen el plegamiento y ciclación de la cadena lateral alongada. La síntesis de estos metabolitos secundarios mediante la utilización de sistemas biológicos constituye un área emergente y de gran potencial de crecimiento ya que representa una alternativa a los procesos clásicos de extracción de materia prima vegetal o a la síntesis química convencional. El uso de cultivos de órganos y células vegetales in vitro supone importantes novedades y ventajas tecnológicas en la producción de metabolitos secundarios ya que: los cultivos se pueden seleccionar para la producción específica del compuesto deseado y mantenerse indefinidamente, la disponibilidad del material vegetal no está condicionada por las limitaciones estacionales, ni climáticas al que se encuentran sometidas las plantas cultivadas, el proceso completo de producción, desde la generación de la biomasa hasta la purificación del compuesto se puede integrar en el mismo espacio físico, someter a control y adecuar a la demanda, sin necesidad del almacenamiento al que están obligados, los procedimientos extractivos debido a la estacionalidad de la producción de plantas, la producción de metabolitos por métodos biológicos frente a métodos de extracción de materia prima vegetal o síntesis química mejora la aceptación por el consumidor, a la vez que es más respetuoso con el medio ambiente, las condiciones de producción no son demasiado severas, lo que implica reducción del coste de equipamiento y material, existe una mayor especificidad de transformación biológica que en la síntesis química, como por ejemplo, en la obtención de isómeros, permite la síntesis de compuestos que no se pueden obtener por otros métodos o por cultivos agronómicos y permite el desarrollo de programas de selección de líneas sobreproductoras. El empleo de elicitores, definidos como moléculas de diverso origen que, introducidas en pequeñas concentraciones en un sistema celular vivo, son capaces de alterar el metabolismo, consiguiendo incrementar la producción de un metabolito en particular, es quizás hoy en día, el método más común para aumentar la producción de metabolitos secundarios en cultivos in vitro de células vegetales. Entre lo diferentes elicitores destacan el ácido jasmónico y su derivado más activo el jasmonato de metilo (JM) ya que son moléculas sintetizadas de manera natural por las plantas, que regulan muchos procesos fisiológicos relacionados con el crecimiento, el desarrollo, la fertilidad y la senescencia y están implicados en la señalización local y sistémica del estrés biótico y abiótico así como en la regulación de la expresión de genes relacionados con la defensa. Por otro lado, las ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos cíclicos formados por 6, 7 u 8 unidades de glucopiranosa unidas por enlaces glucosídicos ? (1'4), que se denominan ?, ? y ? CDs, respectivamente, que inducen respuestas de defensa vegetal. Las CDs Estos compuestos naturales se producen a partir de la degradación enzimática del almidón por acción de la enzima ciclodextrín-glicosil-transferasa presentes en distintos microorganismos del género Bacillus. La elicitación con CDs incrementa la producción de metabolitos secundarios, principalmente aquellos relacionados con la defensa, mediante la inducción de la expresión de los genes responsables de su biosíntesis. La principal característica que presentan las CDs es la capacidad de formar complejos de inclusión. La cavidad interior de las CDs es apolar, por lo que estos compuestos son capaces de albergar moléculas hidrófobas más pequeñas para formar los complejos. En consecuencia, moléculas insolubles en agua pueden llegar a ser completamente solubles, en disoluciones acuosas de CDs, sin que se produzcan modificaciones químicas en la molécula huésped, ya que no se origina ningún enlace covalente durante la interacción entre las CDs y la molécula insoluble en agua. La elicitación sirve también para estudiar los mecanismos de señalización celular implicados en esta respuesta. Así, como resultado de la percepción del elicitor por parte de proteínas receptoras de membrana, tienen lugar una serie de eventos tempranos que incluyen: cambios en los flujos de iones a través de la membrana plasmática y endomembranas; acidificación del citoplasma causada por la inactivación de ATP-asas de H+, despolarización de la membrana plasmática y alcalinización del medio extracelular; activación de patrones de proteín quinasas (PQ); activación de NADPH oxidasas, responsables de la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) como H2O2 y biosíntesis de óxido nítrico (NO); activación transcripcional de sus correspondientes genes de respuesta de defensa y síntesis o acumulación de metabolitos secundarios. A la vista de los antecedentes descritos anteriormente, el objetivo general de la presente memoria se centra en un análisis funcional de la producción de metabolitos secundarios mediante la utilización de sistemas biológicos como son los cultivos celulares vegetales sometidos a elicitación con JM y CDs. Para ello, se analizarán los eventos tempranos implicados en la cascada de señalización intracelular así como, la expresión de los genes que se encuentran implicados en las rutas biosintéticas que se activan como respuestas de defensa vegetal. Adicionalmente, la actividad biológica de los diferentes metabolitos secundarios obtenidos será evaluada frente a diferentes líneas celulares tumorales. Estudio del mecanismo de señalización en cultivos de células de Nicotiana elicitados con jasmonato de metilo y ciclodextrinas El objetivo general que se plantea es el estudio de eventos tempranos que siguen a la percepción de JM y CDs por células de Nicotiana, así como su relación con eventos tardíos concretamente con la producción de fitoalexinas (capsidiol). Estos resultados han permitido generar un modelo de vías de señalización intracelular activadas por la elicitación de suspensiones celulares vegetales con JM y CDs. Nuestros resultados indican que la adición de JM y/o CDs a cultivos celulares de N. plumbaginifolia que expresan aecuorina en el citosol, provocaron un incremento de la concentración de calcio citosólico libre ([Ca2+]cit), además en presencia de CDs la respuesta fue dosis-dependiente. Este incremento de [Ca2+]cit fue promovido, en ambos casos, por la entrada de Ca2+ desde medio extracelular a través de diferentes tipos de canales permeables al Ca2+. Además, la elevación de [Ca2+]cit en células elicitadas con JM fue independiente de eventos de fosforilación de proteínas y de la producción de H2O2. Sin embargo, el aumento de [Ca2+]cit inducido por CDs fue dependiente de la activación de serina/treonina PQ y de H2O2, que a su vez, activó canales de Ca2+ sensibles a H2O2. Estos resultados indicaron la existencia de dos rutas de señalización intracelular diferentes para ambos elicitores. De la misma manera, la adición de JM y/o CDs a cultivos celulares de N. tabacum indujo un estallido oxidativo. El tratamiento con JM provocó niveles máximos de H2O2, en todos los casos la producción de H2O2 fue regulada por la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular y por eventos de fosforilación de proteínas. La acción conjunta de ambos elicitores provocó una acumulación de H2O2 inferior a la producida en el tratamiento en el que se adiciona sólo JM. Por otra parte, la adición de JM a cultivos celulares de N. tabacum indujo la producción de NO posiblemente a través de una óxido nítrico sintasa. La producción de NO inducida por JM fue dependiente de Ca2+ pero no de H2O2 ni de eventos de fosforilación sensibles a estaurosporina. Sin embargo, la adición de CDs a células de N. tabacum no provocó un incremento de NO. La acción conjunta de ambos elicitores provocó una acumulación de NO inferior a la producida en el tratamiento en el que se adiciona sólo JM. Teniendo en cuenta todos los resultados, podemos concluir que las CDs actúan regulando la vía de señalización dirigida por JM ya que en su presencia neutraliza el fuerte estrés oxidativo y nitrosativo inducido por JM y por tanto, regulan los niveles de H2O2 y NO. Análisis metabolómico y genómico integrado en cultivos celulares de Vitis vinifera cv Monastrell elicitados con ciclodextrinas y jasmonato de metilo Para el desarrollo de este capítulo se utilizó el cultivo celular de V. vinifera cv. Monastrell elicitado con CDs y JM separadamente o en combinación como un sistema modelo de alto rendimiento para la producción de trans-resveratrol, en el que se abordaron los objetivos siguientes: 1) el estudio del perfil de expresión de los genes que codifican para las enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de trans-resveratrol durante la elicitación de cultivos celulares de V. vinifera con JM y CDs por separado o en combinación. 2) el estudio de la actividad citotóxica del trans-resveratrol obtenido de cultivos celulares de V. vinifera elicitados con JM y CDs. Nuestros resultados indican que la adición de JM y CDs a cultivos celulares de V. vinifera provocó un efecto sinérgico sobre la producción de trans-resveratrol ya que la suma de la producción individual de JM y CDs fue inferior a la observada en presencia de ambos elicitores. Asimismo, el análisis del perfil de expresión génica mostró que CDs y JM añadidos separadamente o en combinación estimularon la expresión de PAL, C4H, 4CL y STS de forma independiente a CHS (enzima clave de la ruta de flavonoides), indicando que estos elicitores son capaces de inducir la ruta de biosíntesis de estilbenos de manera muy específica. Por este motivo, el efecto sinérgico sobre la producción de trans-resveratrol puede ser el resultado del efecto sinérgico observado sobre la expresión de los genes de la ruta fenilpropanoide. Por otra parte, la aplicación de trans-resveratrol inhibió la viabilidad celular de tres líneas celulares tumorales (JURKAT E.6, MCF7 y THP1) y esta inhibición fue dependiente tanto de la dosis como del tiempo de incubación del compuesto. El trans-resveratrol también alteró la distribución del ciclo celular de las tres líneas tumorales observándose un aumento de las células en la fase S cuando se utilizaron bajas concentraciones de trans-resveratrol mientras que concentraciones elevadas aumentaron la proporción de células en fase G0/G1 e indujeron apoptosis en todas las líneas celulares. Análisis metabolómico y genómico integrado en cultivos celulares de Catharanthus roseus elicitados con ciclodextrinas y jasmonato de metilo. Para el desarrollo de este capítulo se utilizó el cultivo celular de C. roseus elicitado como un sistema para la producción de alcaloides indólicos, por lo que los objetivos generales que se plantean son los siguientes: 1) la caracterización de la producción de alcaloides indólicos en suspensiones celulares de C. roseus. 2) el estudio del perfil de expresión de los genes que codifican para enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de alcaloides indólicos en cultivos celulares de C. roseus elicitados con JM y CDs separadamente o en combinación. 3) el estudio de la actividad citotóxica de extractos enriquecidos en alcaloides indólicos obtenidos de cultivos celulares de C. roseus elicitados. Los resultados indicaron que las condiciones óptimas para la producción de ajmalicina y catarantina en cultivos celulares de C. roseus consistieron en la estimulación durante 192 horas con 50 mM de CDs, 100 ?M JM y exposiciones cortas con luz UV-C (15 minutos). Además, la producción de ajmalicina y catarantina se incrementó utilizando una densidad celular elevada (200 g pf/ L). Así, la mejora en la producción de estos dos compuestos no sólo dependió de la dosis óptima de elicitores sino también de la densidad celular utilizada y el tiempo de elicitación. Por lo tanto se puede concluir que el uso combinado de elicitores puede considerarse una estrategia novedosa para la producción industrial de ajmalicina y catarantina. Por otro parte, el análisis del perfil de expresión génica mostró que la adición de CDs solas o en combinación con JM estimularon la expresión génica de G10H, SLS, TDC, STR, SGD y T16H mientras que el tratamiento con JM sólo induce la expresión de STR y TDC, lo que indica que la activación de estas enzimas es suficiente para activar la cascada de biosíntesis que dirige la producción de ajmalicina y catarantina. Además, el uso combinado de JM y CDs indujo la máxima producción de alcaloides indólicos y ésta producción se correlacionó con la máxima expresión de los genes implicados en su ruta de biosíntesis. Además, nuestros resultados mostraron la potente actividad citotóxica del extracto enriquecido en alcaloides indólicos obtenido a partir de cultivos celulares elicitados de C. roseus en comparación con la actividad citotóxica observada por otros autores. De hecho, en todos los casos, el valor de IC50 frente a líneas celulares tumorales de leucemia fue inferior a los valores de IC50 recogidos en la bibliografía. Además, esta actividad citotóxica no se debió a la acción de un único compuesto ya que tanto la catarantina como la ajmalicina comerciales no presentaron una potente actividad citotóxica cuando se ensayaron solas o en combinación, por lo que el efecto citotóxico podría deberse al efecto sinérgico de los cuatro compuestos presentes en el extracto.