• Título:  CAMBIOS ADAPTATIVOS CARDIACOS DURANTE LA DEPENDENCIA DE MORFINA. IMPLICACION DE LA PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO HSP-27
• Autor:  Martínez Laorden, Elena
• Universidad:  Universidad de Murcia
• Departamento:  Farmacología
• Fecha de Lectura:  05/05/2014
• Programa de doctorado:  PROGRAMA DE DOCTORADO EN INTEGRACIÓN Y MODULACIÓN DE SEÑALES EN BIOMEDICINA
• Dirección: 
  • LAORDEN CARRASCO, MARÍA LUISA (DIRECTOR)
  • Almela Rojo, Pilar (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • Puig Riera De Conias, Margarita (PRESIDENTE)
  • Núñez Parra, María Cristina (SECRETARIO)
  • HERRERO EZQUERRO, MARIA TRINIDAD (VOCAL)
  • ESCUDERO PASTOR, ELISA (VOCAL)
  • RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ, RAQUEL EMILIA (VOCAL)
• Descriptores: 
  • FARMACOLOGIA
• Localización:  Universidad
• http://digitum.um.es/xmlui/handle/10201/38986
• Resumen:
  RESUMEN Actualmente se sabe que hay una estrecha relación entre adicción y desórdenes cardiacos. Sin embargo, se conoce muy poco acerca de los mediadores y mecanismos implicados. Nuestros objetivos han sido: 1. Valorar la actividad simpática cardiaca, determinando los niveles de NA y normetanefrina (NMN). Como posibles mecanismos implicados evaluamos: -la expresión de las dos isoformas de la enzima COMT y - la expresión y fosforilación en serina 40 y 31 de la proteína TH. 2. Evaluar el grado de estrés que se produce durante la adicción a morfina valorando la respuesta del eje HHA y la puesta en marcha de mecanismos cardioprotectores. Se cuantificaron los niveles plasmáticos de ACTH y corticosterona y se valoró la expresión de Hsp27 y la fosforilación de la misma. 3. Investigar un posible nexo de unión entre Hsp27 y troponinas para ello valoramos la expresión de Hsp27, TnT y TnI, así como su co-localización. 4. Valorar el papel de los receptores de CRF1 en la actividad del sistema noradrenérgico cardiaco y del eje HHA. También se valoró la implicación de estos receptores en la expresión y fosforilación de Hsp27. Para ello se utilizó el antagonista selectivo de receptores de CRF1 (CP-154,526) y ratones genéticamente deficientes del receptor de CRF1 (CRF-/-, knockout, KO). Metodología Se han utilizado ratas (Sprague-Dawley) y ratones (B6,129 CRHtklee) macho (WT, CRF1R+/+) y homocigotos recesivos (KO, CRF1R-/-). La dependencia de morfina se indujo mediante la implantación subcutánea de pellets de morfina base (75mg) o mediante inyección i.p. de dosis crecientes de morfina (10-60 mg/kg). Para la precipitación del síndrome de abstinencia se utilizó naloxona (1 o 2 mg/kg, s.c.). El análisis de ACTH y corticosterona se realizó mediante un kit de radioinmunoanálisis (RIA). Se utilizó cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) con detector electroquímico para la determinación de NA y NMN. Las proteínas Hsp27 total y fosforilada, las troponinas y la mu-calpaina se determinaron mediante western-blot. Se realizaron experimentos con inmunofluorescencia para determinar Hsp total y las troponinas TnT y TnI; así como para la co-localización de Hsp27 con TnT y TnI. Resultados y conclusiones -Durante el síndrome de abstinencia a morfina se produce un aumento de la expresión de las dos isoformas de COMT, que serían las responsables del aumento de NMN y, por tanto, del turnover de NA. Asimismo, observamos un aumento de la expresión y de la fosforilación de TH . Estos últimos resultados indicarían la puesta en marcha de mecanismos post-transcripcionales. -El síndrome de abstinencia a morfina cursa con una hiperactivación del eje HHA, como indica los elevados niveles plasmáticos de ACTH y corticosterona. Propranolol y SL-327 fueron capaces de antagonizar el incremento de ACTH y no de corticosterona, lo que sugiere que mecanismos independientes de la ACTH hipofisaria mediarían la respuesta de las suprarrenales. -Durante la dependencia de morfina se produce un aumento en la expresión de Hsp27, lo que corrobora que la adicción a opioides provoca un importante estrés celular. Además, nuestro estudio demuestra que los receptores ?-adrenérgicos y la vía de señalización ERK estaría implicada en la fosforilación de Hsp27 y, por tanto, en los efectos cardioprotectores que induce esta proteína. Así mismo se evidencia una co-localización entre Hsp27 y cTnT, lo que sugiere la existencia de algún tipo de interacción entre ambas proteínas. -Estos resultados demuestran que el bloqueo selectivo de los receptores de CRF1 y la deleción genética de los receptores de CRF1 antagonizan los cambios adaptativos cardiacos, lo que sugiere que los fármacos antagonistas que tengan como diana el receptor de CRF1 podrían mejorar el estrés y los efectos nocivos cardiacos inducidos durante el síndrome de abstinencia a morfina. ABSTRACT There is a close relationship between addiction and cardiac disorders. However, very little is known about the mediators and mechanisms implicated. Our aims were: 1) To evaluate the cardiac sympathetic activity by determining the levels of NA and normetanephrine (NMN). Asses possible mechanisms involved:-expression of the two isoforms of COMT and - the expression and phosphorylation of TH at serine 40 and 31. 2) To assess the degree of stress that occurs during addiction to morphine assessing the response of the HPA axis and cardioprotective mechanisms. Plasma ACTH and corticosterone levels were quantified and Hsp27 expression and phosphorylation of TH was evaluated. 3) To investigate a possible link between Hsp27 and troponin. For it expression of Hsp27, TnT and TnI, and their co-localization was determined. 4) To evaluate the role of CRF1 receptors in the activity of cardiac noradrenergic system and the HPA axis. The involvement of these receptors in the expression and phosphorylation of Hsp27 was also assessed. Selective CRF1 receptor antagonist (CP-154, 526) and mice genetically deficient CRF1 receptor (CRF-/- knockout, KO) was used. Methods We used rats (Sprague-Dawley) and mice (B6, 129 CRHtklee) male (WT, CRF1R + / +) and homozygous recessive (KO, CRF1R-/ -). Morphine dependence was induced by subcutaneous implantation of pellets of morphine base (75mg) or by ip injection increasing doses of morphine (10-60 mg / kg). For precipitation of withdrawal naloxone (1 or 2 mg / kg, sc) was administered. The ACTH and corticosterone analysis was done using a radioimmunoassay kit (RIA). We used liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detector for NA and NMN determination. Total and phosphorylated Hsp27 proteins, troponins and mu-calpain were determined by western-blot. Immunofluorescence experiments were performed to determine the total Hsp TnT and TnI and troponin, as well as for the co-localization of Hsp27 with TnT and TnI. Results and conclusions - During morphine withdrawal we observed an increased expression of the two isoforms of COMT, which are responsible of increased NMN and therefore the NA turnover. We also observed increased expression and phosphorylation of TH. These latter results indicate the involvement of post-transcriptional mechanisms. - Morphine withdrawal induced an activation of the HPA axis, as indicated by elevated plasma levels of ACTH and corticosterone. Propranolol and SL-327 were able to antagonize the increase in ACTH but not in corticosterone, suggesting that separate mechanisms mediate pituitary ACTH adrenal response. - Morphine dependence produced an increased Hsp27 expression, corroborating that opioid addiction causes major cellular stress. Furthermore, our study demonstrates that the ?-adrenergic receptors and ERK signaling would be involved in the phosphorylation of HSP27 and therefore in the cardioprotective effects induced by this protein. Also colocalization between Hsp27 and cTnT is evidence suggesting the existence of some interaction between the two proteins. - These results demonstrate that selective blockade of CRF1 receptors and genetic deletion of CRF1 receptors antagonized the cardiac adaptive changes observed during morphine withdrawal, suggesting that CRF1 receptor antagonists may improve stress and harm cardiac induced during morphine withdrawal.