• Título:  KONPOSATU BIOAKTIBOEN USTIAPENERAKO METODO ANALITIKOEN GARAPENA/DEVELOPMENT OF ANALYTICAL METHODS FOR THE EXPLOITATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS // KONPOSATU BIOAKTIBOEN USTIAPENERAKO METODO ANALITIKOEN GARAPENA/DEVELOPMENT OF ANALYTICAL METHODS FOR THE EXPLOITATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS
• Autor:  AIZPURUA OLAIZOLA, OIER
• Universidad:  Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
• Departamento:  Química analítica
• Fecha de Lectura:  14/12/2015
• Mención Europeo / Mención Internacional: concedido
• Programa de doctorado:  Programa Oficial de Doctorado en Contaminación y Toxicología Ambientales
• Dirección: 
  • NAVARRO VILLAVERDE, PATRICIA (DIRECTOR)
  • USOBIAGA EPELDE, ARESATZ (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • ETXEBARRIA LOIZATE, NESTOR (PRESIDENTE)
  • MENDIOLA LEON, JOSÉ ANTONIO (SECRETARIO)
  • SOYDANER, UMUT (VOCAL)
• Descriptores: 
  • ESPECTROSCOPIA DE MASAS
• Localización:  REPOSITORIO INSTITUCIONAL E.H.U./U.P.V.
• http://hdl.handle.net/10810/17495
• Resumen:
  Tesi hau bi zutabe nagusitan banatzen da. Lehenengoan ardo hondakinen balioa handitzeko metodologia bat garatu da. Lehenik, ardo hondakinetatik polifenolak eta gantz azidoak bakoitza bere aldetik erauzteko jariakin gainkritiko bidezko erauzketa (SFE) optimizatu da. Polifenolak ez dira oso egonkorrak ordea eta gorputzean bioeskuragarritasun baxua dute. Arazo hauek konpontzeko polifenolak zurrusta-bibrazio bidezko mikrokapsularatzearen (VNM) bidez enkapsulatu dira.Bigarren zutabean aldiz etorkizun hurbilean kannabisa sendagai bezala erabili ahal izateko 3 urrats eman dira. Alde batetik, landare ezberdinak efektu ezberdinekin lotzea ahalbidetu dezakeen landareen kannabinoideen hatz-marka osatzeko fragmentazio bikoitzeko masa-espektometriari akoplaturiko eraginkortasun handiko likido kromatografia (HPLC-MS/MS) bidezko metodo bat garatu da. Bestalde, gernuan eta plasman kannabinoideak eta euren metabolitoak kuantifikatzeko metodo bat ere garatu da, hidrolisi entzimatiko-alkalino bikoitza eta HPLC-MS/MS analisi teknika erabiliz. Azkenik, konposatu puruen eta landare mota jakinen produkzioa optimizatzeko, kemotipo ezberdineko landareen hazkuntzan zeharreko kannabinoideen eta terpenoen garapena aztertu daHurrengo orrialdeetan, bi zutabe nagusi hauetako helburuak gauzatzeko burututako lanen laburpenak azaltzen dira.Ardo hondakinetatik gantz azido asegabeak eta polifenolak bereizita erauzteaLan honetan ardo hondakinetatik konposatu bioaktiboak erauzteko bi urratseko jariakin gainkritiko bidezko erauzketa (SFE Supercritical Fluid Extraction) optimizatu da, eta ondorioz, lehen urratsean gantz azidoak soilik eta bigarren urratsean polifenolak soilik erauztea lortu da.Gantz azidoak apolarrak dira, polifenolak ordea polarrak. Ezberdintasun horretan oinarritzen da diseinatutako erauzketa konposatu bakoitza bere aldetik erauzteko. Lehenik, CO2 soilik erabiliz ardo hondakinetatik gantz azidoak erauztea lortu da, eta ostean albo-disolbatzaile gisa metanola gehituz polifenolak erauztea. Ahalik eta konposatu gehien erauzteko beharrezkoa da ordea bi urrats hauek bata bestearen atzetik egin aurretik bakoitza bere aldetik optimizatzea. Horretarako, lehendabizi tenperatura, CO2 fluxua, presioa eta erauzketa denboraren eragina aztertu dira urrats bakoitzean, eta polifenolen kasuan baita gehitutako albo-disolbatzailearen ehunekoa ere.Gantz azidoen erauzketan estatistikoki eragina duten aldagaiak CO2 fluxua eta presioa direla ikusi da. Hala, horiek balio altuetan finkatu dira eta denbora eta tenperatura aldiz balio baxuetan, ez baitute eraginik. Polifenolen kasuan eragina dutenak CO2 fluxua eta erabilitako albo-disolbatzailearen portzentaia izan dira. Ondorioz, horiek balio altuetan finkatu dira eta eraginik ez duten aldagaiak, kasu honetan tenperatura eta presioa balio baxuetan. Erauzketa jarraietan 5 minutuko erauzketak aski direla ikusi da.Behin urrats bakoitza bere aldetik optimizatu ostean, bata bestearen atzetik aplikatu dira ardo hondakinetatik lehenik gantz azidoak eta ostean polifenolak erauzi ahal izateko. Hala, lehen urratsean CO2 soilik erabiliz inongo polifenolik erauzi gabe gantz azido ia denak erauztea lortzen dela ikusi da, eta ostean, metanola gehituta polifenol guztiak erauzten direla bigarren urratsean.Garatutako erauzketa metodoa lagin erreal ezberdini aplikatu zaie, errendimendu handiak lortuz oso erauzketa denbora laburretan (5 min) eta tenperatura baxuetan (35 °C).Polifenolen mikrokapsularatzea egonkortasuna hobetzekoPolifenolek gaitasun antioxidatzaile handia dute, horri esker erradikal askeak neutralizatzeko gai dira arrisku txikiagoko konposatuak emanez gero. Gaitasun hori dela eta hainbat aplikazio ezberdinetarako egokiak dira konposatu hauek; hala nola hanturak tratatzeko, minbiziaren gisako endekapenezko gaixotasunetarako edo kosmetikan zahartzearen aurkako tratamenduetarako. Bestalde, nootropiko bezala zerrendatuak daude, garunean oroimena, arreta eta motibazioa gisako funtzioak bultzatzen laguntzen baitute.Polifenolek egonkortasun baxua dute ordea. Hori dela eta, zurrusta-bibrazio bidezko mikrokapsularatzea (VNM Vibration Nozzle Microencapsulation) erabili da 150 eta 300 ¿m-ko zurrustekin kaltzio-alginatozko eta kaltzio-alginato-kitosanezko tamaina ezberdinetako polifenolen mikrokapsulak eratzeko.Horretarako, prozesu horretan eragina duten aldagai instrumentalak optimizatu dira lehendabizi. 4 aldagai nagusi daude eragina izan dezaketenak: agente kapsulatzailearen eta kapsulatu nahi diren konposatuen nahastearen fluxu laminarra osatzeko ezarririko presioa, fluxua banakako tanta nimiñoetan bihurtzen duen bibrazioaren maiztasuna, tantatxo hauek banatzeko aplikaturiko boltajea, eta gogortze disoluziora dagoen distantzia. 4 aldagai hauek zurrusta bakoitzaren kasuan optimizatuak izan dira.Baldintza optimoekin erdietsitako mikrokapsulak liofilizazio bidez lehortu eta haien egonkortasuna aztertu da zenbait baldintzetan (4°C-tara ilunpean eta giro tenperaturan ilunpean eta argipean) 6 hilabetetan zehar. Horretarako ardo hondakinetako polifenol nagusiak diren katekinaren eta epikatekinaren kontzentrazioa jarraitu da kapsuletan eta emaitzei zentzua eman ahal izateko kapsulatu gabeko erauzkin berdinaren degradazioa ere jarraitu da. Kitosana gehigarri gisa erabiltzea ere aztertu da. Kapsulatutako polifenolen egonkortasuna baldintza guztietan kapsulatu gabeena baino askoz ere handiagoa dela ikusi da, kitosana gehigarri gisa erabiltzeak egonkortasunak are gehiago hobetzen dituela ikusi delarik.Kannabis landareen kannabinoideen hatz-marka osatzeko metodologiaren garapenaGaur egun jakinak dira kannabisak dituen hainbat ezaugarri eta erabilera; esate baterako anorexia, minbizien fase aurreratu edo HIES kasuetan lagungarri den gosea pizteko baliagarria dela; minbiziak sendatzeko erabiltzen den kimioterapia errazago jasateko efektu antiemetikoa duela; minbiziek, HIESak eta fibromialgia edo erreuma-artritisaren gisako gaixotasunek eragindako min neuropatiko kronikoari aurre egin diezaiokela eta esklerosi anizkoitza tratatzeko erabili daitekeela.Bestalde, oraindik guztiz frogatuak egon ez arren, geroz eta ikerketa zientifiko gehiagok babesten dute kannabisa beste gaixotasun askotarako irtenbide garrantzitsua izan daitekeela; hala nola hainbat minbizia sendatzeko, epilepsia tratatzeko eta Alzheimerrari, Hungtintonen gaixotasunari, diabetes kasuei zein Touretten sindromeari aurre egiteko.Kannabis landarea ez da batere sinplea ordea. Izan ere, 554 konposatutik gora identifikatu dira bertan, horien artean 113 kannabinoide. Kannabinoide horietako bakoitzak aktibitate terapeutiko ezberdina du eta, ondorioz, aplikazio ezberdinetarako erabili daitezke. Hortaz gain, euren artean eragin sinergikoa gertatzen da; esaterako jakina da kannabidiolak (CBD) tetrahidrokannabinolaren (THC) eragin euforikoa modulatzen duela.Milaka kannabis barietate ezagutzen dira gaur egun, eta kopurua handituz doa egunetik egunera, efektu ezberdinak lortu nahian barietate ezberdinak elkarren artean gurutzatzen baitira berriak sortzeko. Kontuak hala, landare jakinak aplikazio jakinekin lotu nahi badira beharrezkoa da batetik landare estandarizatuak izatea eta bestetik konposatuen kontzentrazioen araberako sailkapen berri bat finkatzea.Horretara dator gauzatutako lana. Bertan, landareen kannabinoideen hatz-marka osatzeko metodologia garatu da. Horretarako kannabinoideak SFE bidez erauzi eta aurrez optimizatutako HPLC-MS/MS metodo baten bidez neurtu dira. Bestalde, estandarrak eskuragarri ez zeuden kannabinoideen kasuan neurketa kualitatiboa egin da, eta euren egiturak hegaldi-denbora bati akoplatutako kuadrupolo bati lotutako UPLC sistemaren bidez berretsi dira.Garatutako metodoa landare jakinak euren efektu terapeutikoekin lotzeko lagungarria izan daitekeela uste da.Kannabinoideen eta metabolitoen gernu eta plasma analisiakKannabisak aplikazio ezberdinetarako duen erabilgarritasuna aztertzeko saiakera kliniko gehiagoren beharra agerikoa da. Bestalde, saiakera hauetan oso lagungarria da gorputzak xurgatutako kannabinoideen eta hauen metabolitoen kontzentrazioak ezagutzea gero hauek kannabisa hartzeak eragindako efektuekin erlazionatu ahal izateko. Helburu horrekin, lan honetan THC eta honek gorputzean osatzen dituen bi metabolito nagusiak diren 11-hidroxi- ¿9-tetrahidrokannabinola (11-OH-THC) eta 11-nor-9-karboxi- ¿9-tetrahidrokannabinola (THC-COOH), CBD, CBG, THCV eta CBN kuantifikatzeko HPLC-MS/MS bidezko metodoa garatu eta balioztatu da.Kannabinoideak, zein hauetatik osatutako metabolitoak, hein batean glukuronizatu egiten dira gorputzean. Kannabinoidearen edo metabolitoaren arabera glukuronido lotura ezberdinak osatzen dituzte gainera, eter eta ester loturak hain zuzen ere. Kannabinoideen eta metabolitoen kontzentrazio totala jakiteko beharrezkoa da beraz lotura glukuronido hauek haustea. Ildo horretatik, lehenik eta behin hidrolisi prozesu ezberdinek bi lotura mota hauek hausteko duten gaitasuna aztertu da, bai gernuan eta baita plasman. Horretarako, plasma- eta gernu-lagin zuriei THC-glukuronido (eter lotura) eta THCCOOH-glukuronido (ester lotura) estandarrak gehitu zaizkie kontzentrazio ezagun batean. Dopatutako lagin zuri hauei hidrolisi mota ezberdinak aplikatu zaizkie: hidrolisi entzimatikoa ß-glukuronidasa erabiliz, hidrolisi alkalinoa sodio hidroxidoa erabiliz eta hidrolisi entzimatiko-alkalino bikoitza hidrolisi metodo bakoitza bata bestearen atzetik aplikatuz. Bertan, hidrolisi entzimatiko-alkalino bikoitzak lotura glukuronido guztien % 100 haustea ziurtatzen duela ikusi da.Behin hidrolisi metodoa zehaztuta garatutako teknika gernuan eta plasman balioztatu da. Horretarako THC, 11-OH-THC, THC-COOH, CBD, CBG, THCV eta CBN estandarren kontzentrazio ezagunekin dopatutako lagin zuriei analisi prozesu osoa aplikatu zaie: hidrolisi bikoitza, SPE bidezko erauzketa eta HPLC-MS/MS bidezko analisia. Erdietsitako zehaztasuna % 84 eta % 115 artekoa izan da eta egun barneko eta egunen arteko balioen desbiderapena % 12 baino txikiagoa kasu guztietan. Metodoaren detekzio mugak 1 ng/mL-tik beherakoak izan dira analito guztientzat eta balioztatutako metodoa kannabis erabiltzaileen gernu- eta plasma-laginak aztertzeko erabili da behar bezalako emaitzak erdietsiz.Kannabinoideen eta terpenoen garapena kemotipo ezberdineko landareen hazkuntzan zeharSaiakera klinikoetan erabiltzeko beharrezkoa da kannabinoide zein terpeno puruak edo hauen kontzentrazio ratio jakinak dituzten landareak eskala handian ekoiztea. Bide horretan, kannadiol azidoa (CBDA) % 15etik gora eta tetrahidrokannabinol azidoa (THCA) % 1etik behera duen barietate bat lortu zen 2014an . Dena den, ekoizpena guztiz optimizatzeko beharrezkoa da konposatu hauek landarearen hazkuntzan zehar duten garapena ulertzea.Hori dela eta, lan honetan kannabinoide eta terpeno nagusien garapena aztertu da 7 kannabis barietate ezberdinen (3 THCA altukoak, 3 CBDA altukoak eta 1 bien kontzentrazio parekokoa) hazkuntza-prozesu osoan zehar. Horretarako, ama-landare bakoitzaren 50 klon landatu dira eta barnean hazi dira hiru fase ezberdinetan. Lehen fasean klonak 25 x 25 mm-ko kubotxoetan eduki dira 18 orduko argi-zikloetan sustraiak hazi arte. Orduan 2 L-ko ontzietara pasa eta landareen hazkuntza gauzatu da (bigarren fasea), 18 orduko argi-zikloetan baita. Azken fasean, landareak 10 L-ko ontzietara pasa eta 12 orduko argi-zikloa ezarriz loratzea eragin da. Astero landare bakoitzetik 3 klon moztu eta analizatu dira. 8 kannabinoideren jarraipena egin da diodo-segiden detektoreari (DAD Diode Array Detector) akoplaturiko HPLC bidez eta 28 terpenoren jarraipena garraren bidezko ionizazio-detektagailuari loturiko gas kromatografiaren bidez (GC-FID Gas Chromatography ¿ Flame Ionization Detector).Kemotipo ezberdinen hazkuntza-prozesuak aztertuz ondorio ezberdinak atera dira lan honetan. Alde batetik, kemotipo bakoitza definitzen duen THCA eta CBDAren arteko ratioa, hasieratik agerikoa eta hazkuntzan zehar egonkorra dela. Hau garrantzitsua da auzitegi helburuetarako. Izan ere, gaur egun landare bat legezkoa den erabakitzeko loratze faserarte itxaroten baita. Bestalde, CBDA altuko eta THCA-CBDA balio antzekoko landareek kannabinoide eta terpeno nagusien kontzentrazio maximoetara iristeko THCA altuko landareekbaino denbora gehiago behar dutela ikusi da. Hortaz gain, landarean lehendabizi biosintetizatzen den eta beste kannabinoideen oinarri den kannabigerol monometil eter azidoaren (CBGA) biosintesi abiaduraren eta bertatik datorren THCA-ren sintesi abiaduraren arteko erlazioa nahiko egonkorra dela ikusi da, ez ordea CBDA-ren kasuan. Bestalde, ezberdintasunak aurkitu dira monoterpenoen eta seskiterpenoen artean, lehenengoak loratze-fasean ugaritzen doazelarik eta bigarrengoak ez. Azkenik, kemotipo bakoitzaren bereizgarri diren terpenoak ere aurkitu dira, hau kannabinoideen eta terpenoen arteko sinergiak aztertzeko lagungarria izan daitekeelarik.Tesi honetan oinarrituz publikatutako lanak1 O. Aizpurua-Olaizola, U. Soydaner, E. Özturk, D. Schibano, Y. Simsir, P. Navarro, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Evolution of the Cannabinoid and Terpene Content during the Growth of Cannabis sativa Plants from Different Chemotypes. Journal of Natural Products (2016) DOI: 10.1021/acs.jnatprod.5b009492 O. Aizpurua-Olaizola, P. Navarro, A. Vallejo, M. Olivares, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Microencapsulation and storage stability of polyphenols fron Vitis vinisfera grape wastes. Food Chemistry (2016) 190, 614.6213 O. Aizpurua-Olaizola, M. Ormazabal, A. Vallejo, M. Olivares, P. Navarro, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Optimization of supercritical fluid consecutive extractions of fatty acids and polyphenols from Vitis Vinisfera Grape Wastes. Journal of Fodd Science. 80 (1) (2015) 101-107.4 O. Aizpurua-Olaizola; J. Omar; P. Navarro; M. Olivares; N. Etxebarria; A. Usobiaga. Identification and quantification of cannabinoids in cannabis sativa L. plants by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 406 (2014) 7549-7560.5 O. Aizpurua-Olaizola, A. Vallejo, M. Olivares, P. Navarro, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Mahatsak txerritzen. Ekaia, 2015. DOI:10.1387/ekaia.14524. // Tesi hau bi zutabe nagusitan banatzen da. Lehenengoan ardo hondakinen balioa handitzeko metodologia bat garatu da. Lehenik, ardo hondakinetatik polifenolak eta gantz azidoak bakoitza bere aldetik erauzteko jariakin gainkritiko bidezko erauzketa (SFE) optimizatu da. Polifenolak ez dira oso egonkorrak ordea eta gorputzean bioeskuragarritasun baxua dute. Arazo hauek konpontzeko polifenolak zurrusta-bibrazio bidezko mikrokapsularatzearen (VNM) bidez enkapsulatu dira.Bigarren zutabean aldiz etorkizun hurbilean kannabisa sendagai bezala erabili ahal izateko 3 urrats eman dira. Alde batetik, landare ezberdinak efektu ezberdinekin lotzea ahalbidetu dezakeen landareen kannabinoideen hatz-marka osatzeko fragmentazio bikoitzeko masa-espektometriari akoplaturiko eraginkortasun handiko likido kromatografia (HPLC-MS/MS) bidezko metodo bat garatu da. Bestalde, gernuan eta plasman kannabinoideak eta euren metabolitoak kuantifikatzeko metodo bat ere garatu da, hidrolisi entzimatiko-alkalino bikoitza eta HPLC-MS/MS analisi teknika erabiliz. Azkenik, konposatu puruen eta landare mota jakinen produkzioa optimizatzeko, kemotipo ezberdineko landareen hazkuntzan zeharreko kannabinoideen eta terpenoen garapena aztertu daHurrengo orrialdeetan, bi zutabe nagusi hauetako helburuak gauzatzeko burututako lanen laburpenak azaltzen dira.Ardo hondakinetatik gantz azido asegabeak eta polifenolak bereizita erauzteaLan honetan ardo hondakinetatik konposatu bioaktiboak erauzteko bi urratseko jariakin gainkritiko bidezko erauzketa (SFE Supercritical Fluid Extraction) optimizatu da, eta ondorioz, lehen urratsean gantz azidoak soilik eta bigarren urratsean polifenolak soilik erauztea lortu da.Gantz azidoak apolarrak dira, polifenolak ordea polarrak. Ezberdintasun horretan oinarritzen da diseinatutako erauzketa konposatu bakoitza bere aldetik erauzteko. Lehenik, CO2 soilik erabiliz ardo hondakinetatik gantz azidoak erauztea lortu da, eta ostean albo-disolbatzaile gisa metanola gehituz polifenolak erauztea. Ahalik eta konposatu gehien erauzteko beharrezkoa da ordea bi urrats hauek bata bestearen atzetik egin aurretik bakoitza bere aldetik optimizatzea. Horretarako, lehendabizi tenperatura, CO2 fluxua, presioa eta erauzketa denboraren eragina aztertu dira urrats bakoitzean, eta polifenolen kasuan baita gehitutako albo-disolbatzailearen ehunekoa ere.Gantz azidoen erauzketan estatistikoki eragina duten aldagaiak CO2 fluxua eta presioa direla ikusi da. Hala, horiek balio altuetan finkatu dira eta denbora eta tenperatura aldiz balio baxuetan, ez baitute eraginik. Polifenolen kasuan eragina dutenak CO2 fluxua eta erabilitako albo-disolbatzailearen portzentaia izan dira. Ondorioz, horiek balio altuetan finkatu dira eta eraginik ez duten aldagaiak, kasu honetan tenperatura eta presioa balio baxuetan. Erauzketa jarraietan 5 minutuko erauzketak aski direla ikusi da.Behin urrats bakoitza bere aldetik optimizatu ostean, bata bestearen atzetik aplikatu dira ardo hondakinetatik lehenik gantz azidoak eta ostean polifenolak erauzi ahal izateko. Hala, lehen urratsean CO2 soilik erabiliz inongo polifenolik erauzi gabe gantz azido ia denak erauztea lortzen dela ikusi da, eta ostean, metanola gehituta polifenol guztiak erauzten direla bigarren urratsean.Garatutako erauzketa metodoa lagin erreal ezberdini aplikatu zaie, errendimendu handiak lortuz oso erauzketa denbora laburretan (5 min) eta tenperatura baxuetan (35 ¿C).Polifenolen mikrokapsularatzea egonkortasuna hobetzekoPolifenolek gaitasun antioxidatzaile handia dute, horri esker erradikal askeak neutralizatzeko gai dira arrisku txikiagoko konposatuak emanez gero. Gaitasun hori dela eta hainbat aplikazio ezberdinetarako egokiak dira konposatu hauek; hala nola hanturak tratatzeko, minbiziaren gisako endekapenezko gaixotasunetarako edo kosmetikan zahartzearen aurkako tratamenduetarako. Bestalde, nootropiko bezala zerrendatuak daude, garunean oroimena, arreta eta motibazioa gisako funtzioak bultzatzen laguntzen baitute.Polifenolek egonkortasun baxua dute ordea. Hori dela eta, zurrusta-bibrazio bidezko mikrokapsularatzea (VNM Vibration Nozzle Microencapsulation) erabili da 150 eta 300 ¿m-ko zurrustekin kaltzio-alginatozko eta kaltzio-alginato-kitosanezko tamaina ezberdinetako polifenolen mikrokapsulak eratzeko.Horretarako, prozesu horretan eragina duten aldagai instrumentalak optimizatu dira lehendabizi. 4 aldagai nagusi daude eragina izan dezaketenak: agente kapsulatzailearen eta kapsulatu nahi diren konposatuen nahastearen fluxu laminarra osatzeko ezarririko presioa, fluxua banakako tanta nimi¿oetan bihurtzen duen bibrazioaren maiztasuna, tantatxo hauek banatzeko aplikaturiko boltajea, eta gogortze disoluziora dagoen distantzia. 4 aldagai hauek zurrusta bakoitzaren kasuan optimizatuak izan dira.Baldintza optimoekin erdietsitako mikrokapsulak liofilizazio bidez lehortu eta haien egonkortasuna aztertu da zenbait baldintzetan (4¿C-tara ilunpean eta giro tenperaturan ilunpean eta argipean) 6 hilabetetan zehar. Horretarako ardo hondakinetako polifenol nagusiak diren katekinaren eta epikatekinaren kontzentrazioa jarraitu da kapsuletan eta emaitzei zentzua eman ahal izateko kapsulatu gabeko erauzkin berdinaren degradazioa ere jarraitu da. Kitosana gehigarri gisa erabiltzea ere aztertu da. Kapsulatutako polifenolen egonkortasuna baldintza guztietan kapsulatu gabeena baino askoz ere handiagoa dela ikusi da, kitosana gehigarri gisa erabiltzeak egonkortasunak are gehiago hobetzen dituela ikusi delarik.Kannabis landareen kannabinoideen hatz-marka osatzeko metodologiaren garapenaGaur egun jakinak dira kannabisak dituen hainbat ezaugarri eta erabilera; esate baterako anorexia, minbizien fase aurreratu edo HIES kasuetan lagungarri den gosea pizteko baliagarria dela; minbiziak sendatzeko erabiltzen den kimioterapia errazago jasateko efektu antiemetikoa duela; minbiziek, HIESak eta fibromialgia edo erreuma-artritisaren gisako gaixotasunek eragindako min neuropatiko kronikoari aurre egin diezaiokela eta esklerosi anizkoitza tratatzeko erabili daitekeela.Bestalde, oraindik guztiz frogatuak egon ez arren, geroz eta ikerketa zientifiko gehiagok babesten dute kannabisa beste gaixotasun askotarako irtenbide garrantzitsua izan daitekeela; hala nola hainbat minbizia sendatzeko, epilepsia tratatzeko eta Alzheimerrari, Hungtintonen gaixotasunari, diabetes kasuei zein Touretten sindromeari aurre egiteko.Kannabis landarea ez da batere sinplea ordea. Izan ere, 554 konposatutik gora identifikatu dira bertan, horien artean 113 kannabinoide. Kannabinoide horietako bakoitzak aktibitate terapeutiko ezberdina du eta, ondorioz, aplikazio ezberdinetarako erabili daitezke. Hortaz gain, euren artean eragin sinergikoa gertatzen da; esaterako jakina da kannabidiolak (CBD) tetrahidrokannabinolaren (THC) eragin euforikoa modulatzen duela.Milaka kannabis barietate ezagutzen dira gaur egun, eta kopurua handituz doa egunetik egunera, efektu ezberdinak lortu nahian barietate ezberdinak elkarren artean gurutzatzen baitira berriak sortzeko. Kontuak hala, landare jakinak aplikazio jakinekin lotu nahi badira beharrezkoa da batetik landare estandarizatuak izatea eta bestetik konposatuen kontzentrazioen araberako sailkapen berri bat finkatzea.Horretara dator gauzatutako lana. Bertan, landareen kannabinoideen hatz-marka osatzeko metodologia garatu da. Horretarako kannabinoideak SFE bidez erauzi eta aurrez optimizatutako HPLC-MS/MS metodo baten bidez neurtu dira. Bestalde, estandarrak eskuragarri ez zeuden kannabinoideen kasuan neurketa kualitatiboa egin da, eta euren egiturak hegaldi-denbora bati akoplatutako kuadrupolo bati lotutako UPLC sistemaren bidez berretsi dira.Garatutako metodoa landare jakinak euren efektu terapeutikoekin lotzeko lagungarria izan daitekeela uste da.Kannabinoideen eta metabolitoen gernu eta plasma analisiakKannabisak aplikazio ezberdinetarako duen erabilgarritasuna aztertzeko saiakera kliniko gehiagoren beharra agerikoa da. Bestalde, saiakera hauetan oso lagungarria da gorputzak xurgatutako kannabinoideen eta hauen metabolitoen kontzentrazioak ezagutzea gero hauek kannabisa hartzeak eragindako efektuekin erlazionatu ahal izateko. Helburu horrekin, lan honetan THC eta honek gorputzean osatzen dituen bi metabolito nagusiak diren 11-hidroxi- ¿9-tetrahidrokannabinola (11-OH-THC) eta 11-nor-9-karboxi- ¿9-tetrahidrokannabinola (THC-COOH), CBD, CBG, THCV eta CBN kuantifikatzeko HPLC-MS/MS bidezko metodoa garatu eta balioztatu da.Kannabinoideak, zein hauetatik osatutako metabolitoak, hein batean glukuronizatu egiten dira gorputzean. Kannabinoidearen edo metabolitoaren arabera glukuronido lotura ezberdinak osatzen dituzte gainera, eter eta ester loturak hain zuzen ere. Kannabinoideen eta metabolitoen kontzentrazio totala jakiteko beharrezkoa da beraz lotura glukuronido hauek haustea. Ildo horretatik, lehenik eta behin hidrolisi prozesu ezberdinek bi lotura mota hauek hausteko duten gaitasuna aztertu da, bai gernuan eta baita plasman. Horretarako, plasma- eta gernu-lagin zuriei THC-glukuronido (eter lotura) eta THCCOOH-glukuronido (ester lotura) estandarrak gehitu zaizkie kontzentrazio ezagun batean. Dopatutako lagin zuri hauei hidrolisi mota ezberdinak aplikatu zaizkie: hidrolisi entzimatikoa ¿-glukuronidasa erabiliz, hidrolisi alkalinoa sodio hidroxidoa erabiliz eta hidrolisi entzimatiko-alkalino bikoitza hidrolisi metodo bakoitza bata bestearen atzetik aplikatuz. Bertan, hidrolisi entzimatiko-alkalino bikoitzak lotura glukuronido guztien % 100 haustea ziurtatzen duela ikusi da.Behin hidrolisi metodoa zehaztuta garatutako teknika gernuan eta plasman balioztatu da. Horretarako THC, 11-OH-THC, THC-COOH, CBD, CBG, THCV eta CBN estandarren kontzentrazio ezagunekin dopatutako lagin zuriei analisi prozesu osoa aplikatu zaie: hidrolisi bikoitza, SPE bidezko erauzketa eta HPLC-MS/MS bidezko analisia. Erdietsitako zehaztasuna % 84 eta % 115 artekoa izan da eta egun barneko eta egunen arteko balioen desbiderapena % 12 baino txikiagoa kasu guztietan. Metodoaren detekzio mugak 1 ng/mL-tik beherakoak izan dira analito guztientzat eta balioztatutako metodoa kannabis erabiltzaileen gernu- eta plasma-laginak aztertzeko erabili da behar bezalako emaitzak erdietsiz.Kannabinoideen eta terpenoen garapena kemotipo ezberdineko landareen hazkuntzan zeharSaiakera klinikoetan erabiltzeko beharrezkoa da kannabinoide zein terpeno puruak edo hauen kontzentrazio ratio jakinak dituzten landareak eskala handian ekoiztea. Bide horretan, kannadiol azidoa (CBDA) % 15etik gora eta tetrahidrokannabinol azidoa (THCA) % 1etik behera duen barietate bat lortu zen 2014an . Dena den, ekoizpena guztiz optimizatzeko beharrezkoa da konposatu hauek landarearen hazkuntzan zehar duten garapena ulertzea.Hori dela eta, lan honetan kannabinoide eta terpeno nagusien garapena aztertu da 7 kannabis barietate ezberdinen (3 THCA altukoak, 3 CBDA altukoak eta 1 bien kontzentrazio parekokoa) hazkuntza-prozesu osoan zehar. Horretarako, ama-landare bakoitzaren 50 klon landatu dira eta barnean hazi dira hiru fase ezberdinetan. Lehen fasean klonak 25 x 25 mm-ko kubotxoetan eduki dira 18 orduko argi-zikloetan sustraiak hazi arte. Orduan 2 L-ko ontzietara pasa eta landareen hazkuntza gauzatu da (bigarren fasea), 18 orduko argi-zikloetan baita. Azken fasean, landareak 10 L-ko ontzietara pasa eta 12 orduko argi-zikloa ezarriz loratzea eragin da. Astero landare bakoitzetik 3 klon moztu eta analizatu dira. 8 kannabinoideren jarraipena egin da diodo-segiden detektoreari (DAD Diode Array Detector) akoplaturiko HPLC bidez eta 28 terpenoren jarraipena garraren bidezko ionizazio-detektagailuari loturiko gas kromatografiaren bidez (GC-FID Gas Chromatography ¿ Flame Ionization Detector).Kemotipo ezberdinen hazkuntza-prozesuak aztertuz ondorio ezberdinak atera dira lan honetan. Alde batetik, kemotipo bakoitza definitzen duen THCA eta CBDAren arteko ratioa, hasieratik agerikoa eta hazkuntzan zehar egonkorra dela. Hau garrantzitsua da auzitegi helburuetarako. Izan ere, gaur egun landare bat legezkoa den erabakitzeko loratze faserarte itxaroten baita. Bestalde, CBDA altuko eta THCA-CBDA balio antzekoko landareek kannabinoide eta terpeno nagusien kontzentrazio maximoetara iristeko THCA altuko landareekbaino denbora gehiago behar dutela ikusi da. Hortaz gain, landarean lehendabizi biosintetizatzen den eta beste kannabinoideen oinarri den kannabigerol monometil eter azidoaren (CBGA) biosintesi abiaduraren eta bertatik datorren THCA-ren sintesi abiaduraren arteko erlazioa nahiko egonkorra dela ikusi da, ez ordea CBDA-ren kasuan. Bestalde, ezberdintasunak aurkitu dira monoterpenoen eta seskiterpenoen artean, lehenengoak loratze-fasean ugaritzen doazelarik eta bigarrengoak ez. Azkenik, kemotipo bakoitzaren bereizgarri diren terpenoak ere aurkitu dira, hau kannabinoideen eta terpenoen arteko sinergiak aztertzeko lagungarria izan daitekeelarik.Tesi honetan oinarrituz publikatutako lanak1 O. Aizpurua-Olaizola, U. Soydaner, E. ¿zturk, D. Schibano, Y. Simsir, P. Navarro, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Evolution of the Cannabinoid and Terpene Content during the Growth of Cannabis sativa Plants from Different Chemotypes. Journal of Natural Products (2016) DOI: 10.1021/acs.jnatprod.5b009492 O. Aizpurua-Olaizola, P. Navarro, A. Vallejo, M. Olivares, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Microencapsulation and storage stability of polyphenols fron Vitis vinisfera grape wastes. Food Chemistry (2016) 190, 614.6213 O. Aizpurua-Olaizola, M. Ormazabal, A. Vallejo, M. Olivares, P. Navarro, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Optimization of supercritical fluid consecutive extractions of fatty acids and polyphenols from Vitis Vinisfera Grape Wastes. Journal of Fodd Science. 80 (1) (2015) 101-107.4 O. Aizpurua-Olaizola; J. Omar; P. Navarro; M. Olivares; N. Etxebarria; A. Usobiaga. Identification and quantification of cannabinoids in cannabis sativa L. plants by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 406 (2014) 7549-7560.5 O. Aizpurua-Olaizola, A. Vallejo, M. Olivares, P. Navarro, N. Etxebarria, A. Usobiaga. Mahatsak txerritzen. Ekaia, 2015. DOI:10.1387/ekaia.14524.