• Título:  DISEÑO E INGENIERÍA DE LACASAS QUIMÉRICAS POR EVOLUCIÓN DIRIGIDA PARA EL TRATAMIENTO DE BIOMASA VEGETAL.
• Autor:  Pardo Mendoza, Isabel
• Universidad:  Universidad Complutense de Madrid
• Departamento:  Microbiología III
• Fecha de Lectura:  13/05/2016
• Mención Europeo / Mención Internacional: concedido
• Programa de doctorado:  Programa Oficial de Doctorado en Microbiología y Parasitología
• Dirección: 
  • CAMARERO FERNANDEZ, SUSANA (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • MARTÍNEZ PEINADO, JOSÉ (PRESIDENTE)
  • PATIÑO ÁLVAREZ, AURORA BELÉN (SECRETARIO)
  • ALCALDE GALEOTE, MIGUEL (VOCAL)
  • HERNÁNDEZ CUTULI, MANUEL (VOCAL)
  • MARTINS, LIGIA O. (VOCAL)
• Descriptores: 
  • ENZIMOLOGIA
• Localización:  E-PRINTS COMPLUTENSE
• https://eprints.ucm.es/id/eprint/42994/
• Resumen:
  El objetivo general de esta tesis doctoral fue la ingeniería de lacasas de alto potencial redox mediante técnicas de evolución dirigida para su aplicación en el tratamiento de la biomasa vegetal. Para ello, se han realizado tres tareas: 1) Se han obtenido lacasas quiméricas a partir de las variantes previamente evolucionadas en el laboratorio de las lacasas de los basidiomicetos PM1 y Pycnoporus cinnabarinus, empleado estrategias de quimeragénesis aleatorias y racionales. Las nuevas lacasas quiméricas presentan perfiles de actividad distintos de los de los parentales y/o mayor estabilidad, lo cual las hace puntos de partida interesantes para su posterior ingeniería hacia nuevos retos. 2) Se han desarrollado nuevos ensayos colorimétricos de determinación de actividad lacasa en formato de high-throughput screening (HTS) para la exploración de las librerías de mutantes generadas por evolución dirigida. Estos incluyen tres ensayos basados en la oxidación de fenoles de tipo siringilo derivados de la lignina (ácido sinápico, acetosiringona y siringaldehído), un ensayo específico para lacasas de alto potencial redox basado en la oxidación del mediador sintético ácido violúrico, y tres ensayos basados en la decoloración (directa o en presencia de mediadores redox) de tintes orgánicos sintéticos (azul de Evans, naranja de metilo y azul brillante de remazol). 3) Partiendo de una de las lacasas quiméricas obtenidas en esta tesis, se ha empleado una estrategia de diseño semi-racional con el fin de mejorar la actividad lacasa sobre mediadores fenólicos derivados de la lignina, realizando mutagénesis saturada iterativa (ISM) sobre seis residuos del bolsillo de unión a sustrato. Las librerías de mutantes fueron exploradas con el ensayo de HTS con ácido sinápico desarrollado en esta tesis. Así, se seleccionaron variantes que presentaban constantes de reacción mayores hacia este sustrato y hacia su análogo sinapato de metilo, pero no hacia otros fenoles relacionados. Las causas de estas mejoras fueron evaluadas mediante cálculos computacionales de PELE y QM/MM. Por último, se realizó un multi-screening con varios de los mutantes generados por ISM para evaluar la oxidación de otros tipos de fenoles de origen vegetal, encontrando que algunos mutantes mejoraban su actividad sobre sustratos de interés como el ácido felúrico, el resveratrol o el eugenol.