• Título:  GENERACIÓN DE MICROQUIMERISMO PRENATAL PARA DONANTES EN XENOTRASPLANTE
• Autor:  Abellaneda Cuadrado, Juana Maria
• Universidad:  Universidad de Murcia
• Departamento:  Escuela Internacional de Doctorado de la Universidad de Murcia
• Fecha de Lectura:  03/02/2017
• Programa de doctorado:  Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias por la Universidad de Murcia
• Dirección: 
  • Ramis Vidal, Manuel Guillermo (DIRECTOR)
  • PALLARÉS MARTÍNEZ, FRANCISCO JOSÉ (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • Ramírez Romero, Pablo (PRESIDENTE)
  • MAJADO MARTÍNEZ, M. JULIANA (SECRETARIO)
  • QUEREDA TORRES, Juan José (VOCAL)
• Descriptores: 
  • TRASPLANTE DE ORGANOS
  • PRODUCCION ANIMAL
  • PORCINOS
• Localización:  BIBLIOTECA GENERAL DE LA UNIVERSIDAD
• https://digitum.um.es/xmlui/handle/10201/52258
• Resumen:
  No hay duda que el poder disponer de órganos animales para trasplante solucionaría el problema de su escasez. Pero para que los xenotrasplantes puedan llegar a ser una realidad clínica, se deben superar varias barreras, siendo una de la más importante la barrera inmunológica. Durante los últimos años las líneas de investigación han estado dirigidas a la creación de estrategias para la inducción de tolerancia inmunológica tanto de las células T como B. Una estrategia especialmente prometedora para acercarnos a la xenotolerancia es conseguir tolerancia de las células B, mediante la obtención del quimerismo mixto hematopoyético. El objetivo de este trabajo ha sido generar lechones con quimerismo mixto mediante la inyección ecoguiada intrauterina de un número bajo de diferentes estirpes celulares humanas y determinar posteriormente la resistencia al rechazo hiperagudo in vitro mediante técnicas clásicas. Para lograr este objetivo se procedió a la puesta a punto de una técnica ecográfica ecoguiada intrauterina, incluyendo pruebas de citotoxicidad de un contraste sonográfico mediante análisis celular en tiempo real. Finalmente se procedió a la inyección ecoguiada de 15 cerdas, usando distintas densidades de células STEM humanas CD34+, células mononucleares totales de sangre de cordón umbilical y células mesenquimales de médula ósea. Cuatro de las cerdas inyectadas parieron lechones vivos. En estos animales se determinó la presencia de quimerismo mixto in vitro mediante diferentes técnicas clásicas: PCR, citometría de flujo (CF), inmunocitoquímica y técnica ELISA para determinación de albúmina humana. Además, se realizaron pruebas de hemólisis in vitro mediante sistema RTCA xCELLigence y el método clásico (APA). Utilizando CF para identificar células con HLA I A, B o C en sangre periférica de todos los lechones nacidos vivos a los 15 días de edad, se encontraron 13 positivos de 58 lechonestestados, procedentes de dos de las inyecciones realizadas. La presencia de más animales positivos de los inyectados nos indica que hubo tránsito de dichas células humanas entre hermanos de camada. Estos 13 animales positivos fueron testados de nuevo a los dos meses de edad y ninguno fue positivo, demostrando la desaparición de las células quiméricas o humanas con el paso del tiempo. Mediante q-PCR para la detección del gen Alu Yb8 humano, se analizaron las muestras sanguíneas y tejidos de animales muertos perinatalmente (N=8), así como el tejido hepático (n= 59), cardiaco (n=53), renal (n=54) e intestino grueso y delgado (n=63) de los animales nacidos vivos procedentes de cerdas inyectadas. En los animales muertos perinatalmente se encontró el gen humano en distintos tejidos y en mayor cantidad que en los animales nacidos vivos (p<0,001). En sangre periférica de lechones nacidos vivos se encontró ADN humano en más animales de los que fueron inyectados en cada camada, al igual que sucedía en la CF. Esto confirmaría que habría tráfico celular entre los lechones durante la gestación. En cuanto a los tejidos de estos lechones, se determinó la presencia de Alu humano en el 37,74% de las muestras cardiacas, el 54,2% de las muestras hepáticas y el 16,7% de las muestras renales y no se pudo determinar la presencia de células humanas en ninguna muestra de intestino delgado o grueso. En los animales positivos por CF se detectó este gen en PBMCs, hígado y corazón, con una frecuencia significativamente mayor que en los que fueron negativos para HLA I en sangre. Se observó una diferencia significativa al comparar la densidad de Alu en animales positivos y negativos a HLA I, pero para interpretar estos resultados hay que tener en cuenta que los datos de CF utilizados fueron aquellos obtenidos en la primera prueba realizada, cuando los animales tenían 15 días de edad, mientras que los resultados de Alu en tejidos son los que se obtuvieron a los 80 y 175 días de edad para los animales negativos y positivos por CF, respectivamente. El hecho de que los animales negativos a CF, sacrificados con anterioridad a los animales positivos, muestren valores medios superiores a los segundos, indicaría que se ha ido perdiendo el quimerismo y que en los animales sacrificados más tarde la cantidad de ADN humano detectable es menor. Mediante inmunocitoquímica, no se observaron células teñidas en ninguno de los tejidos valiosos para trasplante (hígado, riñón, corazón o pulmón). Sin embargo, en algunas de las muestras de bazo se observaron hematíes inmunorreactivos al anticuerpo anti-HLA. Tampoco se encontró albumina humana mediante ELISA. Finalmente, se determinó la resistencia al RHA mediado por anticuerpos y complemento mediante la técnica clásica de hemólisis (APA) y se evaluó la hemólisis mediante la puesta a punto y uso de una técnica de análisis celular en tiempo real (RTCA). Se encontró que mediante APA clásica se apreciaba un nivel de hemólisis significativamente creciente al comparar animales CF+, CF- y no modificados. Se observaron también diferencias entre los hematíes tomados a los 15 y a los 80 días de vida, con un mayor nivel de hemólisis en estos últimos. La presencia de hematíes con HLA I humano en superficie, como se demostró con la técnica de la inmunocitoquímica, podría explicar la protección frente a la reacción de APA. Además, corroboraría que aquellos animales en los que se observó quimerismo mediante CF tienen menos hemólisis mediada por anticuerpos y complemento, puesto que habría un porcentaje de hematíes que serían humanos, por tanto, no tendrían antígenos ?-gal en superficie y no sufrirían la reacción detonada por los xenoanticuerpos preformados y el complemento. Esta capacidad de protección disminuiría con el tiempo, de forma paralela a la reducción de las copias de ADN humano o de la presencia de células con HLA I en superficie There is no doubt that having animal organs for xenotransplantation will solve the shortage of human tissues for transplantation. But for xenotransplatation to become a clinical reality have to overpass different barriers, such as immunological rejection. During years the research has been focused on different strategies to get donors avoiding this kind of rejection. Among them is the generation of B cells xenotolerance, inducing immunological tolerance against T and B cells. Thus, the aim of this work has been to generate piglets with mixed chimerism through ecoguided in utero cellular injection with a low number of different types of human cells and to determinate the ability of these animals to overpass hyperacute rejection by means of different analytical technics. To achieve this aim, firstly a percutaneous ecoguided technic was designed and refined, including the assessment of cytotoxicity against human and pig cells of an ultrasonographic contrast agent. STEM CD34+ cells, total mononuclear cells from umbilical cord blood and cultured mesenchymal human cells from marrow bone were injected into 15 sows. Four injected sows produced alive piglets. Mixed chimerism was determined in samples from these piglets using flow cytometry (CF), immunohistochemistry, and ELISA to detect human albumin. Moreover, hemolysis assays were performed in a double way: classical APA and APA based in real time cells analysis (RTCA). Using CF the presence of cells having HLA I molecules on surface of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) obtained from piglets on 15th and 80th days was identified. Thirteen out of 58 piglets resulted positive and these animals were born only from two sows. The number of positive piglets higher than injected piglets confirms the cell trafficking among litter matters in utero.By means of real time PCR to detect Alu human gene, human DNA was researched in blood samples, tissue samples from death born piglets (n=8) and liver (n=59), heart (n=53), kidney (n=54) and small and large intestine (n=63) from alive born piglets coming from injected sows. Human DNA was found in higher frequency and quantity in death born piglets (p<0,001). The Alu gene was identified in PBMCs from 33 piglets, confirming thus the cellular trafficking. This gene was also identified in 37.73% of heart samples, 54.2% of liver samples, 16.7% of kidney samples and none of gut and intestine samples. The animals CF+ showed higher frequency of samples with human DNA than CF- animals. There was higher density of Alu copies in CF- animals than in CF+ but it should be taken into account that samples from CF- were obtained 2 months before CF+ samples. All these data point out to a progressive decrease in the number of human cells with the age of the animals. There was no positive immunostained cells for HLA I, except for red blood cells in spleen. There was not found human albumin in sera samples by ELISA. As regards protection against hyperacute rejection, using the hemolysis assays (classical APA and RTCA assay) there was difference comparing CF+ and CF- animals. By means of APA assay, there was significant higher hemolysis percentage comparing CF+, CF- and wild phenotype pigs. There was also higher hemolysis in the second blood sampling compared to the first one. The presence of red blood cells in tissue samples could explain this effect. So, in the CF+ animals would have a certain number of red blood cells of human origin avoiding the effect of anti-alpha-gal antibodies. The difference between the first and the second blood sampling would corroborate again the decrease of the human origin cells in the chimeric animals.