• Título:  UTILIZACIÓN DE LÍNEAS CELULARES DE ONCORHYNCHUS MYKISS PARA EL ESTUDIO DE LA ACCIÓN Y PARA LA SELECCIÓN DE AGENTES INMUNOESTIMULANTES UTILIZABLES EN ACUICULTURA
• Autor:  Fierro Castro, María Camino
• Universidad:  Universidad de León
• Departamento:  Biología molecular
• Fecha de Lectura:  30/10/2009
• Programa de doctorado:  BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA
• Dirección: 
  • VILLENA CORTES, ALBERTO JOSE (DIRECTOR)
  • López Fierro, Pilar (CODIRECTOR)
• Tribunal: 
  • LAMAS FERNÁNDEZ, JESÚS (PRESIDENTE)
  • Razquin Peralta, Blanca E. (SECRETARIO)
  • Diago Egaña, María Luz (VOCAL)
  • ESTEPA PEREZ, MARIA AMPARO (VOCAL)
  • dos Santos Afonso, António Manuel  (VOCAL)
• Descriptores: 
  • INMUNOPATOLOGIA
  • INMUNOLOGIA VETERINARIA
  • CULTIVO CELULAR
• Localización:  BIBLIOTECA UNIVERSITARIA SAN ISIDORO
• Resumen:
  Debido a su creciente impacto económico y social, existe un enorme interés en el desarrollo de la acuicultura, lo que ha producido un gran avance en los estudios sobre la biología de las especies cultivadas o que están en proceso de adaptación a su producción. La acuicultura no está exenta de problemas, el más importante de ellos es el desarrollo de enfermedades infecciosas en las piscifactorías causantes de amplias pérdidas. Dado los problemas medioambientales y para la salud de los consumidores que se derivan del uso de productos antimicrobianos y antiparasitarios (antibióticos, desinfectantes...) en la acuicultura, se hace necesario usar métodos que incrementen la resistencia natural o adquirida frente a los patógenos. Por ello el conocimiento del sistema inmunitario de los peces es clave para el desarrollo de una acuicultura sostenible. Es necesario comprender cómo se desarrollan las respuestas inmunitarias en los peces y así poder utilizar sus propios mecanismos de defensa para controlar las enfermedades infecciosas ya sea mediante vacunación o inmunoestimulación. Las técnicas de inmunoprofilaxis, como la vacunación y la inmunoestimulación, son técnicas con grandes perspectivas en la acuicultura, y están desplazando a los métodos tradicionales basados en la quimioterapia. Sin embargo, todavía existen algunas enfermedades contra las que no se dispone de vacunas efectivas, como son las producidas por virus y otros patógenos intracelulares. Especialmente, algunas bacterias que son patógenos intracelulares facultativos parecen capaces de escapar a la acción de agentes quimioterapeúticos o vacunas y, en ciertas circunstancias, p. e. en condiciones de estrés, los peces portadores sufren y transmiten la enfermedad. Los inmunoestimulantes pueden tener una función importante en la protección contra estas patologías, incrementando las respuestas inmunológicas específicas e inespecíficas, pero especialmente las celulares implicadas en las respuestas defensivas. En mamíferos, algunos inmunoestimulantes, tales como el levamisol, ß-glucanos y LPS, activan las respuestas inmunocelulares, mientras que otros, como RNAs bicatenarios y los polinucleótidos (poli(I) - poli(C), inducen la producción de interferón, que es una de las principales citoquinas implicadas en la defensa anti-viral. La existencia de respuestas semejantes frente a inmunoestimulantes también ha sido puesta de manifiesto en peces, en los que se ha demostrado la expresión de actividad de distintas citoquinas, como MAF, MIF, interferón y TNF. También estos productos activan la producción de metabolitos oxidativos, como el óxido nítrico, que parecen tener una función importante en el control de patógenos intracelulares como R. salmoninarum. Algunos inmunoestimulantes están ya disponibles para su uso comercial, como el M-glucano (un ß-glucano), pero muchos no han sido aún ensayados in vivo. Además, los poli(I) - poli(C) que inducen actividad interferón en salmónidos y protección frente a virus, no han sido utilizados como inmunoestimulantes frente a otras patologías no víricas y, por el contrario, el levamisol ha sido ensayado frente a patologías bacterianas pero no frente a las víricas. Un problema asociado a la experimentación en peces es la elevada variabilidad de las respuestas, en función de la especie, condiciones ambientales en el origen de captura y/o de mantenimiento. Frente a estos problemas, la experimentación in vitro presenta numerosas ventajas, tales como condiciones controladas y repetitivas, la posibilidad de realizar numerosos ensayos repetitivos y en tiempos cortos, con una menor variación individual. Por otra parte, el desarrollo de métodos de ensayos in vitro son parte fundamental de la política de las 3Rs (reducción, refinamiento y reemplazamiento) para optimizar o reemplazar el uso de animales, según establece la legislación Española y Comunitaria. Para el estudio de la acción de los inmunoestimulantes ha predominado el uso de sistemas de ensayos que incluyen cultivos primarios de leucocitos y tejidos, así como el uso de líneas celulares. Generalmente, los cultivos celulares que se han utilizado constituyen cultivos en monocapa (bidimensionales) ricos en un único tipo celular y que presenta ventajas para la manejabilidad y repetitividad del modelo. Sin embargo, su uso no es apropiado cuando se trata de establecer modelos que se asemejan en su comportamiento a la situación in vivo. Así, hoy en día se reconoce que sistemas más complejos, que incluyen varios tipos celulares y cultivos tridimensionales que pueden dar lugar a modelos histotípicos u organotípicos, son mejores sistemas de ensayo para predecir resultados in vivo. Estos modelos más complejos permiten que se establezcan interrelaciones celulares tanto físicas como mediadas por factores humorales (redes de citoquinas y otros factores). Dentro del grupo de trabajo donde se ha llevado acabo esta tesis doctoral, se han desarrollado 2 líneas celulares del estroma de pronefros (TPS-2) y del estroma de bazo (TSS) de trucha arco iris, que están siendo usadas para diversos estudios de patología in vitro y la selección de preparados antigénicos para vacunas en peces. Ambas líneas están formadas por poblaciones celulares heterogéneas de tipo retículo-endotelial que muestran actividad angiogénica in vitro y actividad macrofágica. En base a esto el propósito de esta tesis ha sido: "Analizar la utilización de los cultivos celulares y de los ensayos in vitro para el estudio y selección de substancias candidatas a ser inmunoestimulantes para su uso en acuicultura" Para ello se plantearon los siguientes objetivos: ¿Investigar en las líneas celulares TPS-2 y TSS de O. mykiss las respuestas inducidas por la exposición a inmunoestimulantes conocidos (LPS, Levamisol y Poly I:C), mediante: a. Ensayos biológicos in vitro para determinar los efectos potenciadores de las respuestas inmunitarias innatas. b. Análisis de la expresión de genes inmunorreguladores implicados en las respuestas pro-inflamatorias. ¿Comparar los resultados obtenidos en las líneas TPS-2 y TSS con los observados en cultivos primarios de macrófagos de esa especie. En cuanto a los productos utilizados como inmunoestimulantes, se seleccionaron tres que habían sido previamente bien caracterizados, tanto en estudios in vivo como in vitro, en peces: LPS, Poly I:C y el Levamisol . Un factor importante a la hora de utilizar inmunoestimulantes son las dosis y el tiempo de exposición, para lo cual se tuvieron en cuenta resultados previos descritos por otros autores. Para el desarrollo de los objetivos planteados se ha estudiado la actividad fagocítica, la explosión respiratoria (uno de los mecanismos más importantes de la respuesta inmunitaria innata), la detección de factores liberados activantes de macrófagos MAF, y la producción de óxido nítrico que puede actuar como compuesto microbicida. Además también se analizó los niveles de expresión de los principales genes que interviene en las respuestas inmunitarias como son las citoquinas: Interleuquina 1ß (IL-1ß), la quimioquina IL-8, el factor de necrosis tumoral ¿1 y ¿2 (TNF-¿) o la proteína Mx-1 inducible por INF y la proteína de la cadena ß del complejo principal de histocompatibilidad (MHC-II) que interviene en la respuestas inmunitarias estimulando la respuesta humoral específica de peces; así como también se analizaron la expresión de las enzimas ciclooxigenasa (COX-2), óxido nítrico sintasa inducible iNOS, y la arginasa. Estos ensayos se llevaron acabo inicialmente para la puesta a punto de la técnica mediante RT-PCR y análisis semicuantitativo por densitometría de las bandas de DNA de los geles de agarosa y finalmente se validaron los resultados mediante QPCR o PCR a tiempo real. Tras los ensayos realizamos concluimos: 1.- Las líneas celulares TSS y TPS-2, derivadas respectivamente del estroma del bazo y del pronefros de Oncorynchus mykiss, al igual que los cultivos primarios de macrófagos, responden a la exposición a los inmunoestimulantes LPS, Levamisol y Poly I:C y a actividad MAF incrementando la fagocitosis y la producción de radicales oxidativos, que son algunos de los mecanismos de defensa innata que se producen in vivo tras la inmunoestimulación. Por lo tanto, para salmónidos, ambas líneas celulares pueden ser utilizadas como modelos para la experimentación in vitro que implique ensayos biológicos para esas actividades de la inmunidad innata. 2.- Dichas líneas celulares estromáticas son capaces de elaborar respuestas de tipo proinflamatorio tras la exposición a los inmunoestimulantes LPS, Levamisol y Poly I:C, como demuestra la activación de la expresión génica de las enzimas inducibles COX-2, iNOS y arginasa-2, de las citoquinas IL-1 ß, TNF- ¿, IL-8, de la proteína Mx-1 inducible por interferón y de la cadena ß del MHC-II de O. mykiss. En consecuencia, para salmónidos, las dos líneas celulares pueden ser utilizadas como modelos para la experimentación in vitro que implique ensayos de expresión de genes inmunorreguladores de las respuestas inflamatorias. 3.- Tanto en los ensayos biológicos como en los de expresión de genes inmunorreguladores, las respuestas de las líneas celulares estromáticas TSS y TPS 2 para cada inmunoestimulante difieren cualitativa y cuantitativamente de las observadas en los cultivos primarios de macrófagos para ese mismo inmunoestimulante. Este hecho indica la existencia de procesos de modulación de las respuestas, que se pueden atribuir a las interacciones entre poblaciones celulares heterogéneas presentes en las líneas celulares. 4.- El conjunto de los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que las líneas celulares TSS y TPS-2, que originan cultivos con características histotípicas, pueden ser utilizadas como modelos alternativos a la experimentación in vivo, así como a los cultivos primarios de macrófagos (que requieren el uso continuo de animales para su obtención), para realizar ensayos biológicos y de expresión de genes inmunorreguladores in vitro que estudien el efecto de productos inmunoestimulantes sobre la activación de mecanismos de defensa innata y proinflamatorios en salmónidos.