• Título:  INTERACCIONES ENTRE ACTIVADORES Y REPRESORES EN EL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN EN SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
• Autor:  Peiró Chova, Lorena
• Universidad:  Universitat de València (Estudi General)
• Departamento:  Bioquímica y biología molecular
• Fecha de Lectura:  04/06/2010
• Programa de doctorado:  Biología molecular, celular y genética
• Dirección: 
  • ESTRUCH ROS, FRANCISCO (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • MORENO SANZ, FERNANDO (PRESIDENTE)
  • PÉREZ ORTÍN, JOSÉ ENRIQUE (SECRETARIO)
  • NAVARRO GOMEZ, FRANCISCO (VOCAL)
  • CALVO GARCÍA, OLGA M. (VOCAL)
  • RODRÍGUEZ NAVARRO, SUSANA (VOCAL)
• Descriptores: 
  • BIOLOGIA MOLECULAR
  • BIOQUIMICA
  • LEVADURAS
• Localización:  BIBLIOTECA DEL CAMPUS DE BURJASSOT (UNIVERSITAT DE VALÈNCIA)
• 2010peirointer.pdf
• Resumen:
  Esta Tesis Doctoral se centra en el estudio de las interacciones entre activadores y represores en el inicio de la transcripción en Saccharomyces cerevisiae. El inicio de este trabajo fue el intento de encontrar las causas moleculares de la interacción genética entre bur6-1 (componente del represor transcripcional NC2) y dbp5-2 (factor de exportación) (Estruch y Cole, 2003). Para ello se llevó a cabo un rastreo genómico en busca de supresores multicopia de la letalidad sintética entre estas dos mutaciones, con lo que se identificó una versión truncada de la subunidad de la RNA pol II, Rpb2p (rpb2t). La sobre-expresión de rpb2t también es capaz de suprimir la letalidad sintética entre mot1-301 (otro represor transcripcional) y dbp5-2, así como las deficiencias en el crecimiento del mutante sencillo dbp5-2 a temperatura semi-restrictiva de 34ºC y los defectos en el crecimiento de los mutantes en los componentes de NC2. Con la finalidad de conseguir comprender mejor la función de NC2, se llevó a cabo un rastreo genómico en busca de mutaciones supresoras del requerimiento de NC2 para el crecimiento celular. La mayoría de los supresores, a los que llamamos supresores snd (suppressors of NC2 depletion), se encontraron en genes que codifican componentes bien conocidos de la maquinaria básica de transcripción: 5 mutaciones en IWR1..................Interacting With RNA pol II 3 mutaciones en YMR185w...........Función desconocida (no ha sido objeto de estudio de esta Tesis Doctoral) 8 mutaciones en NUT2/MED10....Componente mediador 1 mutaciones en TFB1...................Componente de TFIIH 1 mutaciones en RPB7...................Subunidad RNA pol II 1 mutaciones en MED7.................Componente mediador 1 mutaciones en SRB2...................Componente mediador La naturaleza de la mayoría de los supresores identificados en este trabajo sugiere que la detención del crecimiento de células con actividad NC2 reducida sería consecuencia de un aumento del nivel de transcripción, y que los supresores funcionarían reduciendo dicho nivel. Así pues, la función esencial de NC2 para el crecimiento resultaría de su papel como represor transcripcional. Se podría postular que la reducción de NC2 podría aumentar el acceso de la RNA pol II a los promotores, provocando un aumento en la transcripción que causaría la inviabilidad celular. Los supresores actuarían alterando la conformación de un componente específico de la holoenzima (Mediador, TFIIH o la propia RNA pol II) de tal modo que provocarían una disminución de la afinidad por otros componentes de la holoenzima, con la consiguiente disminución del acceso de la RNA pol II a los promotores. Pero se han identificado mutaciones en componentes para los que se postula un efecto negativo en la transcripción (como el módulo Srb8-11 del Mediador) que son capaces de compensar parcialmente la reducción de NC2, al igual que se han identificado deleciones en factores con un efecto positivo en la transcripción (Rpb9p, Med2p, Med3p y Gal11p) que empeoran los defectos en el crecimiento causados por actividad reducida de NC2. Por tanto, se puede concluir que la relación entre NC2 y componentes de la maquinaria de activación transcripcional parece ser muy compleja y aún se desconocen los mecanismos funcionales que relacionan al uno con los otros (Peiró-Chova y Estruch, 2007). La segunda parte de la tesis se centra en la identificación, caracterización y estudio de IWR1, otro supresor del requerimiento de NC2 encontrado en nuestro rastreo genómico. Iwr1p ha sido recientemente identificada, mediante aproximaciones proteómicas globales, como un factor transcripcional evolutivamente conservado, que co-purifica con la práctica totalidad de las subunidades de la RNA pol II, así como con TFIIF y con los factores de elongación transcripcional Spt4/Spt5 y Dst1 (Krogan et al., 2006). También se han identificado interacciones genéticas y físicas con componentes de la maquinaria básica de transcripción y con factores de exportación de mRNAs. El rasgo común de los supresores de NC2 identificados en el rastreo genómico es que son componentes de la maquinaria básica de transcripción con un papel positivo en el inicio de la transcripción. En nuestro laboratorio se demostró el papel positivo de Iwr1p en el inicio de la transcripción por la capacidad de esta proteína de activar la transcripción cuando se une artificialmente a un promotor de un gen reportero. Además, hemos encontrado que la localización de Iwr1p no es estática, sino que viaja entre el núcleo y el citoplasma de manera dependiente de Xpo1p. Aunque IWR1 no es un gen esencial, su deleción empeora ligeramente el crecimiento celular, hecho que puede estar relacionado con los defectos en la transcripción génica mostrada por el mutante iwr1. La deleción de IWR1 conduce a una expresión alterada de genes que codifican componentes de la fosforilación oxidativa y de genes regulados por aminoácidos (ARG1), por fuente de carbono (SUC2 y GAL10) o por deficiencia de fosfato (PHO5 y PHO84), pero el efecto en la expresión de estos genes es muy diferente. La deleción de IWR1 aumenta la expresión basal, pero no la inducida, de los genes ATP16 y ARG1, mientras que Iwr1p está involucrada en la inducción de los genes SUC2, GAL1, PHO5 y PHO84, sugiriéndose que la necesidad de Iwr1p es específica de gen. En el caso de SUC2, Iwr1p altera específicamente la inducción tardía de este gen, hecho que podría ser consecuencia de su papel en la eliminación de la represión ejercida por Mig1p. La función de Iwr1p se requiere para la remodelación normal de la cromatina en el promotor del gen PHO5 que se produce en condiciones de baja concentración de fosfato en el medio, y que es necesaria para el reclutamiento del factor transcripcional Pho4p y la RNA pol II. A pesar de su papel en la expersión génica, no se detecta (mediante ChrIP) asociación de Iwr1p a la cromatina de sus genes diana. Por tanto, es posible que la asociación de Iwr1p con la RNA pol II tenga lugar cuando la enzima no está unida a DNA. De esta manera, Iwr1p participaría regulando el reclutamiento de la RNA pol II a promotores específicos, pero abandonaría a la RNA pol II antes de la unión de ésta al DNA (Peiró-Chova y Estruch, 2009). A pesar de todos los resultados recopilados, se necesitarían aun más estudios para esclarecer el mecanismo molecular a través del cual Iwr1p participa en la regulación transcripcional de sus genes diana. Bibliografía: 1.- Estruch, F. and Cole, C.N. 2003. An early function during transcription for the yeast mRNA export factor Dbp5p/Rat8p suggested by its genetic and physical interactions with transcription factor IIH components. Mol Biol Cell 14, 1664-1676. 2.- Krogan et al. 2006. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature 440, 637-643. 3.- Peiró-Chova, L. and Estruch, F., 2007. Specific defects in different transcription complexes compensate for the requirement of the negative cofactor 2 repressor in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 176, 125-138. 4.- Peiró-Chova, L. and Estruch, F., 2009. The yeast RNA polymerase II associated factor Iwr1p is involved in the basal and regulated transcription of specific genes. J Biol Chem 284, 28958-28967.