• Título:  ALTERACIONES DEL ADN DE ESPERMATOZOIDES DE TRUCHA ARCO-IRIS (ONCORHYNCHUS MYKISS) PRODUCIDAS DURANTE LA CONSERVACIÓN SEMINAL: CONSECUENCIAS PARA LA ELABORACIÓN DE BANCOS DE GERMOPLASMA
• Autor:  Pérez Cerezales, Serafín
• Universidad:  Universidad de León
• Departamento:  Biología molecular
• Fecha de Lectura:  11/06/2010
• Programa de doctorado:  BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA
• Dirección: 
  • HERRAEZ ORTEGA, PAZ (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • Carrillo Estévez, Manuel (PRESIDENTE)
  • MARTÍNEZ PASTOR, FELIPE (SECRETARIO)
  • GUTIERREZ ADÁN, ALFONSO (VOCAL)
  • VILELLA, SEBASTIANO (VOCAL)
  • Asturiano Nemesio, Juan Francisco (VOCAL)
• Descriptores: 
  • BIOLOGIA CELULAR
  • BIOLOGIA MOLECULAR
  • REPRODUCCION ANIMAL
  • PISCICULTURA
• Localización:  BIBLIOTECA UNIVERSITARIA SAN ISIDORO
• Resumen:
  La elaboración de bancos de recursos genéticos ha surgido como respuesta a diversas necesidades sociales y económicas de distinta índole. En la actualidad la conservación de gametos y embriones está cobrando un enorme interés tanto desde el punto de vista de la conservación de especies en peligro de extinción, como en la preservación de genotipos de interés comercial o biotecnológico obtenidos mediante selección genética. En algunas especies de peces ya se están elaborando bancos de recursos genéticos con dichos fines y en otras se prevé su potencial aplicación (como es el caso de la trucha arco-iris a nivel de las piscifactorías con fines comerciales y de reintroducción para la pesca deportiva), pero al contrario de otros grupos de vertebrados (como los mamíferos) la imposibilidad de congelar oocitos y embriones hace que la única posibilidad de preservar los recursos genéticos de una especie o población sea a través de la criopreservación seminal. Este procedimiento ha de asegurar la conservación de manera indefinida de la funcionalidad de las células espermáticas, garantizando que tras la congelación-descongelación mantienen su capacidad de fecundar y que el material genético que portan es capaz de soportar correctamente el desarrollo embrionario, preservando la información genética original. Durante la congelación seminal se producen numerosos agentes nocivos que dañan distintas estructuras, afectando a diferentes funciones celulares. Estas alteraciones reducen la eficiencia en la fecundación y comprometen el correcto desarrollo de los nuevos individuos, de tal manera que se pone en peligro la transmisión genética a la siguiente generación. La formación de cristales de hielo que dañan las membranas celulares, y de especies reactivas de oxígeno (ROS) que modifican la naturaleza química de numerosos componentes celulares, son los principales agentes lesivos descritos hasta el momento. Por ello en la optimización de los protocolos de congelación seminal se trata de disminuir los efectos de dichos agentes mediante la optimización de las rampas de temperatura para la congelación-descongelación y el diseño de diluyentes que contengan agentes crioprotectores (metanol, DMSO, glicerol, etc.), estabilizadores de membrana (yema de huevo, BSA, proteínas de soja, etc.) y antioxidantes (ácido cítrico, glutatión, melatonina, etc.). Entre las múltiples estructuras y moléculas que se ven afectadas, el ADN parece especialmente susceptible al daño durante la criopreservación. Diversos trabajos han descrito que durante la congelación-descongelación seminal se produce rotura de las cadenas, así como cambios en la interacción entre el ADN y las protaminas. A pesar de este conocimiento no está todavía claro si un espermatozoide portador de estos daños es capaz de fecundar un oocito de forma natural, o si bien dichas modificaciones del material genético van asociadas a otras lesiones celulares más acusadas que impiden su unión con el gameto femenino. Pero si esto ocurre, la transmisión de la información genética que se trata de preservar, así como la salud de la descendencia, se pueden ver comprometidas. Algunas de las consecuencias de que el ADN dañado del espermatozoide configure el genotipo de un nuevo individuo se han observado en mamíferos cuando se fuerza la fecundación, generando abortos durante el desarrollo y otros efectos subletales en la descendencia adulta (como por ejemplo un aumento de riesgo de padecer cáncer). Sin duda esta problemática puede tener dramáticas consecuencias cuando se aplican técnicas de reproducción asistida en humanos, pudiéndo magnificarse cuando se combinan con la utilización de semen criopreservado. Estas técnicas saltan la selección que ocurre en el tracto genital femenino para eliminar espermatozoides defectuosos e incrementan el riesgo de introducir material genético lesionado para configurar un nuevo individuo. De hecho recientes investigaciones epidemiológicas relacionan la aplicación de estas tecnologías con un incremento en la incidencia de enfermedades poco frecuentes. Por lo tanto se pone de manifiesto la necesidad de caracterizar la naturaleza de las modificaciones que sufre el material genético e identificar y reducir el efecto de los agentes que dañan el ADN durante la criopreservación seminal. Por otra parte es necesario determinar la capacidad de un espermatozoide dañado durante la congelación-descongelación de fecundar el oocito y, si esto ocurre, las implicaciones que tiene para la siguiente generación. La trucha arco-iris (Onchorhynchus mykiss) es una de las especies piscícolas más importantes con fines alimenticios o de reintroducción para la pesca deportiva. La alta competitividad de las empresas ha generado la necesidad de llevar a cabo programas de mejora genética, lo que puede implicar la necesidad de elaborar bancos de germoplasma. Por otra parte se ha producido ya la especialización de la industria, en la cual existen unas explotaciones dedicadas solo a engorde y otras a reproducción. Estas últimas pueden beneficiarse del desarrollo de técnicas de conservación seminal para mejorar los procesos productivos. Además es necesario substituir los antiguos métodos de conservación seminal que se utilizan en dichas explotaciones (conservación unos pocos días a 4 ºC) por un método de conservación indefinido. En este sentido asegurar que el ADN se mantiene intacto tras la congelación permite certificar que tras dicho proceso se mantendrá todo el potencial genético que se trata de preservar. Otro interesante aspecto es el hecho de que esta especie presenta fecundación externa, que implica una serie de ventajas con respecto a los mamíferos que podrían convertirla en un buen modelo para el estudio de los efectos de la fecundación con semen con el material genético dañado. Dichas ventajas pueden resumirse en: la existencia una menor selección espermática a la hora de llevar a cabo la fecundación (siendo menos rigurosa y permitiendo fácilmente la fecundación con semen dañado), la capacidad de obtener una gran cantidad de embriones a partir de un único cruce, el fácil manejo de los progenitores así como la posibilidad de observación y manipulación de los embriones resultantes debido a su desarrollo externo. En un primer trabajo (capítulo uno) se comprobó que durante la conservación seminal a 4 ºC durante 5 días se produjo un grado de fragmentación del ADN similar al observado tras la congelación-descongelación siguiendo el protocolo de congelación comúnmente utilizado para esta especie. No obstante la criopreservación conservó mejor la integridad de la membrana plasmática y posiblemente su capacidad fecundante. Por otra parte en este capítulo se puso a punto una técnica para la detección de bases oxidadas en puntos no fragmentados de la hebra de ADN, lo que permitió comprobar la oxidación de guaninas durante la refrigeración probablemente debida a la existencia de un alto grado de estrés oxidativo y envejecimiento celular durante el tiempo de almacenamiento, que no ocurre durante la criopreservación. Cierto grado de oxidación de bases también puede ocurrir en el semen congelado, pero es posible que todas las bases oxidadas durante la congelación-descongelación se transformen directamente en roturas de las hebras, lo que enmascararía su presencia por su interferencia con el método de detección utilizado. Este trabajo demostró por tanto que la refrigeración causa, en un periodo de 5 días, mayor daño oxidativo que la congelación seminal, En un segundo trabajo (capítulo dos) se trató de mejorar el protocolo de congelación seminal para trucha arco-iris y evaluar su eficacia con muestras de distinta calidad, para lo cual se tomaron muestras en tres momentos del periodo reproductivo. Para ello se substituyó, en la solución de congelación, la yema de huevo (componente original) por su fracción rica en lipoproteinas de baja densidad (LDL) como estabilizador de membrana. Dicha substitución se tradujo en una significativa reducción de los daños en el material genético tras la congelación-descongelación, así como en una mejora de la preservación de la integridad de la membrana plasmática incluso en momentos subóptimos para la congelación. Por otra parte también se comprobó que durante la época reproductiva existen diferencias en la calidad seminal que se ponen de manifiesto como cambios en el grado de fragmentación del ADN antes de que otras estructuras habitualmente analizadas se vean afectadas. Este hecho, unido a la observación de que la resistencia a la congelación presentó una relación directa con el grado de fragmentación del ADN en la muestra sin congelar, ha puesto de manifiesto la importancia de evaluar dicho parámetro como predictivo de la calidad seminal antes de la criopreservación. Una vez conseguida una mejora en el protocolo de congelación, el siguiente paso fue estudiar la producción de ROS durante la congelación-descongelación utilizando ambos estabilizadores de membrana (yema de huevo y LDL) (capítulo 3) así como determinar de qué manera este estrés afecta a la composición química del ADN en términos de oxidación de guaninas y citosinas. Los resultados obtenidos demuestran que la formación de ROS intracelular se produce en las mismas cantidades, generando los mismos niveles de ambas bases oxidadas cuando se utilizan ambos componentes. Sin embargo la fragmentación de la cromatina es menor con el uso de LDL. El efecto beneficioso de este agente se debe fundamentalmente a su asociación con la membrana plasmática, que proporciona una mayor estabilidad de la misma. Se sugiere en este capítulo que la protección aportada por el LDL frente a la fragmentación del ADN indicaría que una parte de la misma es debida a otros factores no relacionados con la producción de ROS. Entre ellos se indican daños mecánicos producidos por la entrada de cristales de hielo en el citoplasma, que tras romper las membranas alcanzarían el interior del núcleo, o los grandes cambios de volumen y forma celular y nuclear que ocurren durante los intercambios de agua y crioprotectores. En este capítulo se han utilizado ambos tipos de muestras congeladas con el fin de fecundar oocitos con diferentes grados de fragmentación del ADN y comprobar su efecto en la supervivencia embrionaria. Se detectó que las muestras congeladas con yema de huevo no presentaban espermatozoides sin daño en el ADN (todas las células presentaron al menos un 10% de fragmentación), observándose que mantuvieron su capacidad de fecundar. Por lo tanto los embriones resultantes de dicho esperma congelado contuvieron todos un pronúcleo masculino con al menos un 10% de fragmentación. La fecundación con estas muestras desencadenó un dramático aumento de los abortos durante el desarrollo embrionario, sugiriendo que se produjo una fecundación con espermatozoides conteniendo un alto grado de daño en el ADN que el oocito fue incapaz de reparar. Por otro lado, parte de los embriones obtenidos con semen criopreservado con los dos estabilizadores de membrana se incubaron con un inhibidor de la vía de reparación de bases por escisión (BER) del oocito durante la primera segmentación. Esta inhibición produjo un incremento de la tasa de abortos, demostrando que existen espermatozoides fecundantes que portan lesiones en el ADN hasta un grado asumible por el oocito, pero que necesitan ser reparados mediante esta vía. Los resultados obtenidos en este trabajo validan la utilidad de este sistema como modelo para llevar a cabo de manera sencilla este tipo de estudios. El éxito reproductivo del uso de semen criopreservado, en términos del porcentaje de embriones que llegan a la eclosión, se ve pues directamente relacionado con la calidad del material genético de las muestras. Sin embargo el principal problema a abordar quizá sea determinar si existen daños subletales que de algún modo ejerzan un efecto nocivo sobre el desarrollo en etapas posteriores de las larvas obtenidas. Para tratar de poner de manifiesto este tipo de modificaciones, en el capitulo cuatro se analizó la transcripción, durante el desarrollo embrionario (en embriones vivos) y tras la eclosión, de 8 importantes genes implicados en multitud de funciones de carácter general en el organismo, tanto durante el desarrollo como en la vida adulta, relacionados con metabolismo, crecimiento y diferenciación celular. Los embriones analizados fueron resultantes de la fecundación con semen congelado con los dos componentes anteriormente citados. Los resultados revelaron que ambas muestras seminales provocaron la sobre-expresión de algunos genes en diferentes momentos del desarrollo. Además se encontró una relación directa entre el número de genes afectados y el grado de fragmentación del ADN de la muestra utilizada, hecho que afectó principalmente a la transcripción en las larvas y no en estadíos previos. Se demostró pues cómo algunos daños o modificaciones genéticas subletales provocadas por la criopreservación permanecen en el embrión y permiten el correcto desarrollo embrionario, poniéndose de manifiesto en etapas posteriores y pudiendo afectar a la funcionalidad de los nuevos individuos.