• Título:  DESARROLLO DE UN SISTEMA EFICAZ DE PRODUCCIÓN DE ALFA-L-RAMNOSIDASA EN ASPERGILLUS NIDULANS UTILIZANDO PROMOTORES DE LOS GENES XILANOLÍTICOS
• Autor:  Tamayo Ramos, Juan Antonio
• Universidad:  Universitat de València (Estudi General)
• Departamento:  C007 - FACULTAT DE CIÈNCIES BIOLÒGIQUES
• Fecha de Lectura:  04/03/2011
• Programa de doctorado:  Genética molecular y evolutiva II
• Dirección: 
  • OREJAS SUÁREZ, MARGARITA (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • CANTORAL FERNÁNDEZ, JESÚS MANUEL (PRESIDENTE)
  • REAL GARCÍA, MARÍA DOLORES (SECRETARIO)
  • MARTÍNEZ HERNANDEZ, MARIA JESUS (VOCAL)
  • HERA DIAZ DE LIAÑO, CONCEPCION  (VOCAL)
  • MANZANARES MIR, PALOMA (VOCAL)
• Descriptores: 
  • BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS
  • HONGOS
  • INGENIERIA GENETICA
  • BIOLOGIA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS
• Localización:  BIBLIOTECA DEL CAMPUS DE BURJASSOT (UNIVERSITAT DE VALÈNCIA)
• Resumen:
  Los hongos filamentosos del género Aspergillus poseen una capacidad excepcional para producir proteínas extracelulares, como celulasas y hemicelulasas. Aunque Aspergillus nidulans no se utiliza a nivel industrial, el hecho de que esté muy bien caracterizado genéticamente, de que las técnicas de ingeniería genética estén muy desarrolladas, y de que su genoma esté secuenciado y la anotación del mismo haya sido recientemente actualizada (http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/aspergillus_group/GenomesIndex.html; http://www.cadre-genomes.org.uk/Aspergillus_nidulans), hacen conveniente su utilización en estudios que, aparte de ser extrapolables a organismos de interés en la industria (Aspergillus niger) y en biomedicina (Aspergillus fumigatus), podrían dar lugar a su paso de organismo modelo genético a factoría biotecnológica alternativa. No en vano, parte de las investigaciones publicadas en los últimos años sobre A. nidulans empiezan a ser financiadas por industrias multinacionales como Monsanto o Merck (Galagan et al., 2005; Lubertozzi y Keasling, 2008). El sistema xilanolítico de A. nidulans consta de al menos tres xilanasas y una beta-xilosidasa, codificadas respectivamente por los genes xlnA, xlnB, xlnC y xlnD. La actividad de estos genes está controlada, a nivel transcripcional, por al menos tres proteínas reguladoras: (i) CreA, que reprime su expresión en presencia de D-glucosa, (ii) XlnR, que activa específicamente su expresión cuando xilano o D-xilosa son la fuente de carbono; y (iii) PacC, que los regula de manera diferente en función del pH ambiental; mientras que la expresión del gen xlnA es mayor a pH alcalino y más aún en fondos genéticos mutantes pacCc (mimetizan las condiciones de crecimiento a ese pH), la expresión de xlnB es mayor en medios ácidos y más aún en fondos genéticos mutantes pacC+/- o pal- (mimetizan el crecimiento a pH ácido). Además, la transcripción de estos genes también es mayor en mutantes creAd30 y xlnRc. Todos estos resultados indican que los promotores de los genes xlnA y xlnB pueden ser una buena alternativa para la expresión de genes heterólogos y además muestran distintas estrategias encaminadas a la mejora genética dirigida de cepas para la sobreproducción de enzimas. La enzima alfa-L-ramnosidasa (EC 3.2.1.40) tiene una gran importancia industrial dada su versatilidad en distintas aplicaciones, como pueden ser su empleo para determinar la estructura de glicósidos, polisacáridos y glicolípidos; reducir el amargor en zumos de cítricos, que es causado por los flavonoides naringina y limonina; producir bebidas funcionales, aumentando la biodisponibilidad de los flavonoides presentes en zumos e infusiones; hidrolizar la hesperidina para obtener L-ramnosa y hesperidín 7-glucósido, un importante precursor de edulcorantes; facilitar la liberación de aromas en mostos de uva y vino, etc. Pese a estas interesantes características, hasta la fecha no se han descrito estudios encaminados hacia la optimización de su producción. La disponibilidad del gen rhaA de Aspergillus aculeatus, que codifica una alfa-L-ramnosidasa (RhaA), nos va a permitir estudiar el potencial del sistema xilanolítico de A. nidulans para la producción de enzimas heterólogas aplicando los conocimientos generados sobre su regulación. En este sentido, también es interesante conocer, de manera global, el efecto que tienen distintas condiciones ambientales (pH-fuente de carbono) y distintos fondos genéticos (xlnR+, Delta xlnR) en la producción de enzimas extracelulares, así como identificar aquellas actividades, beneficiosas o perjudiciales, que se van a producir junto con RhaA. Para ello, sirviéndonos de técnicas de proteómica se pretenden definir aquellas condiciones más favorables para la producción heteróloga de ramnosidasa: mayor eficiencia y mayor calidad (menos contaminación de actividades innecesarias y ausencia de proteasas). En relación con la actividad ramnosidasa, en estudios previos nuestro grupo purificó y caracterizó una alfa-L-ramnosidasa de A. nidulans potencialmente últil en enología. Un rastreo de la secuencia genómica de A. nidulans, utilizando como sondas las proteínas RhaA de A. aculeatus y RamA de Clostridium stercorarium identificó la presencia de cuatro posibles genes candidatos. Tres de ellos se parecen más a la familia de ramnosidasas bacterianas, mientras que el cuarto presenta mayor homología con las ramnosidasas de hongos filamentosos y levaduras. Teniendo en cuenta que hasta la fecha sólo se han caracterizado tres genes codificantes de ramnosidasas fúngicas es interesante caracterizar los presentes en el genoma de A. nidulans, ya que de este modo se dispondría de genes cuyos productos podrían presentar distintas características a los que se conocen hasta el momento. Por otro lado sería posible realizar estudios sobre la regulación de su expresión, ya que hasta la fecha no se ha caracterizado ningún regulador transcripcional que controle la expresión de estos genes en ningún microorganismo.