• Título:  ESTUDIO INTEGRAL DE LA TRICHINELLOSIS SILVESTRE EN EXTREMADURA
• Autor:  Gamito Santos, José Antonio
• Universidad:  Universidad de Extremadura
• Departamento:  Sanidad animal
• Fecha de Lectura:  20/12/2011
• Programa de doctorado:  VETERINARIA
• Dirección: 
  • Serrano Aguilera, Francisco Javier (CODIRECTOR)
  • Pérez Martín, Juan Enrique (CODIRECTOR)
• Tribunal: 
  • Martínez Fernandez, Antonio (PRESIDENTE)
  • Reina Esojo, David (SECRETARIO)
  • Acosta García, Isabel (VOCAL)
  • BOLAS FERNANDEZ, FRANCISCO (VOCAL)
  • Martínez Ubeira, Florencio (VOCAL)
• Descriptores: 
  • INMUNOLOGIA VETERINARIA
  • EPIDEMIOLOGIA
  • HISTOPATOLOGIA
  • PARASITOLOGIA ANIMAL
• Localización:  BIBLIOTECA CENTRAL DE CÁCERES
• 2011gamitestud.pdf
• Resumen:
  Se ha realizado un estudio integral de la trichinellosis silvestre en Extremadura. Para ello, se divide el trabajo en dos grandes bloques. Por una parte, un estudio experimental en jabalí, que es uno de los principales hospedadores de Trichinella, no solo en Extremadura, sino en España e incluso Europa y que, a la vez, se encuentra poco estudiado. Por otro lado, se ha realizado un estudio epidemiológico de la trichinellosis en nuestra Comunidad Autónoma, estudiando hospedadores constatados como el cerdo, el jabalí y el zorro, y posibles hospedadores como aves y mamíferos carnívoros silvestres. A partir de los resultados obtenidos, se elabora un mapa epidemiológico de Trichinella en Extremadura y un Plan de Lucha y Control frente a esta zoonosis. A su vez, en el estudio experimental, se realiza el método micro-ELISA indirecto de dobles anticuerpos, para observar su eficacia diagnóstica comparada con la trichinelloscopia y la digestión pépsica. También, se realiza la técnica Western Blot como complemento al diagnóstico inmunoenzimático por ELISA y se analiza el cuadro lesional histopatológico que producen T. spiralis y T. britovi en el jabalí, para tener un mayor conocimiento del desarrollo de la enfermedad. Por último, también se lleva a cabo un estudio de la distribución muscular y carga parasitaria en estos jabalíes experimentales y se comparan esos resultados con los que se obtienen en el diagnóstico directo de los casos positivos remitidos por los veterinarios del SES. Para el estudio experimental, se han empleado 40 jabalíes procedentes de varias fincas de la provincia de Cáceres, de ambos sexos, de una edad comprendida entre los 2 y los 18 meses al inicio de la experiencia y de unos pesos iniciales que oscilan entre los 3,95 kg y los 60 kg. Estos 40 jabalíes se dividen en dos experiencias infectivas. Así, 22 animales se utilizan para una infección experimental reciente y se sacrifican a los 125 DPI, y los 18 restantes son mantenidos en experimentación por un periodo mayor de tiempo y se sacrifican entre los 201 y los 957 DPI. Del grupo de jabalíes de infección reciente, cuatro jabalíes son mantenidos libres de Trichinella como animales control, mientras que los otros 18 son divididos en dos grupos y se infectan con diferentes dosis (200, 1.000 y 20.000 L1 por animal) de Trichinella spiralis y Trichinella britovi. De cada jabalí, se obtiene suero sanguíneo los días -5, 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105 y 125 DPI. Por su parte, en los jabalíes de infección prolongada, dos animales se utilizan como control y los 16 restantes son infectados con 10.000 ó 20.000 L1 de T. spiralis o T. britovi, realizándose extracciones de sangre con periodicidad mensual. Los animales se sacrifican previo aturdimiento con pistola de bala cautiva, tras lo cual se realiza una necropsia reglada. El nivel de infección de cada animal es determinado por trichinelloscopia y digestión pépsica del diafragma. Además, se realiza estudio de la distribución muscular, analizando la carga parasitaria del diafragma, los sublinguales, los maseteros, la paleta, los flexores-extensores torácicos, el lomo, los intercostales, los abdominales y el jamón. Los controles son diagnosticados como negativos tras la digestión de, al menos, 500 g de musculatura. Tras las digestiones individuales, se evidencia la relación entre la dosis infectante administrada y las larvas por gramo obtenidas. Es reseñable que los jabalíes infectados con T. spiralis poseen una carga parasitaria muy superior a la obtenida en los animales infectados con T. britovi. Además, como músculo preferente en el tropismo larvario destaca el diafragma, seguido de los sublinguales y el masetero. Con el menor tropismo larvario se encuentran los intercostales. Otra generalidad observada, es una distribución muscular más irregular de L1 de Trichinella en los jabalíes con bajas cargas parasitarias. Se realiza el método ELISA indirecto de dobles anticuerpos, de acuerdo a una estandarización previa, utilizando antígeno EBL y ES. Se incuban 100 µl en placas Micro-ELISA 96 de 300 µl de capacidad por pocillo, durante 4 horas a 37ºC, con una concentración antigénica de 3 µg/ml. Las muestras de suero son utilizadas a una dilución 1/1.000 y el conjugado anti-pig IgG a una dilución de 1/25.000. Como sustrato se utiliza TMB al 0,01% y H2O2 (3 µg/ml) en tampón citrato, frenándose la reacción a los 8-10 minutos con H2SO4 3N (50 µl por pocillo). La densidad óptica obtenida a 450 nm es transformada en porcentaje de reactividad con respecto a los sueros control positivo y negativo de cada placa con el objetivo de reducir la variación entre placas. Los valores diagnósticos para cada antígeno, son establecidos en base a los límites de confianza del 90% y 99% de 1.844 sueros de jabalíes procedentes de monterías de toda la región extremeña, negativos a Trichinella spp. por digestión artificial de, al menos, 25 g de pilares de diafragma, determinándose así tres categorías de resultados: animales negativos, dudosos y positivos. En los jabalíes de infección reciente se observa que, ya en el 10 DPI, se produce un ligero aumento en el porcentaje de reactividad en algunos animales y con algunos antígenos; aunque los primeros incrementos significativos se evidencian entre los 15-20 DPI. Cuando la parasitación muscular resulta muy escasa (en lotes infectados con 200 L1), se aprecia un retraso en el comienzo de la producción de anticuerpos. En estas bajas parasitaciones, la mayor respuesta se obtiene sobre el 40-50 DPI en los jabalíes parasitados por T. britovi y sobre el 90-125 DPI en los parasitados por T. spiralis. En los jabalíes con cargas parasitarias altas (infectados con dosis de 20.000 L1), las máximas respuestas de anticuerpos coinciden en el tiempo con los jabalíes infectados con bajas cargas (200 L1) pero el porcentaje de reactividad es mayor en los primeros, obteniéndose en ciertas ocasiones el 120% de reactividad. Atendiendo a la evolución humoral de las dos especies de Trichinella estudiadas, se puede observar un diferente patrón cinético, de manera que en los jabalíes infectados con T. britovi, se obtiene un máximo de respuesta humoral sobre el 30-50 DPI y posteriormente esta respuesta desciende, mientras que en los infectados con T. spiralis la respuesta es más lenta, aumentando paulatinamente hasta el día de sacrificio. En los jabalíes de infección prolongada, se observa que la persistencia de anticuerpos a DPI tan avanzados está muy influenciada por la propia idiosincrasia de cada jabalí, detectándose anticuerpos en jabalíes que han conseguido calcificar las larvas musculares y, por el contrario, perdiéndose la respuesta frente a parasitaciones que todavía presentan larvas viables en la musculatura. En estos jabalíes, se ha realizado un ELISA, utilizando mezcla de antígenos de ambas especies de Trichinella, observándose que no se obtiene una mejora sustancial en el diagnóstico, ya que los falsos negativos siguen sin ser correctamente diagnosticados. La existencia de leves parasitaciones por protozoos (Balantidium coli y Sarcocystis miescheriana), acantocéfalos (Macracanthorhynchus hirudinaceus) y nematodos (Metastrongylus spp., Strongylida spp., Ascarops strongylina y Oesophagostomum dentatum) no producen reacciones cruzadas con Trichinella evidenciables capaces de alterar el resultado negativo de la técnica ELISA. El Western Blot se ha realizado sobre los jabalíes 23, 25, 30, 32, 34, 36, 37 y Control E, utilizando tanto antígeno EBL como ES. Además, se analizan por WB jabalíes abatidos en monterías que dan un resultado negativo por digestión artificial pero que tienen reactividad alta por ELISA. La cantidad de antígeno que se emplea es de 1.000 µg para SDS-PAGE de antígeno EBL y 600 µg para SDS-PAGE de antígeno ES. Este antígeno es diluido 1:4 con Sample buffer. Las muestras de suero son utilizadas a una dilución de 1:8 en TBS-Tw20 caseína 3% y el conjugado anti-pig IgG a una dilución de 1/500 en TBS-Tw20 caseína 3%. Como sustrato se utiliza Cloronaftol y H2O2 en una solución de metanol y TBS, frenándose la reacción mediante aclarados en agua destilada. Tras la realización del Western Blot, se aprecia una analogía evidente con la evolución humoral evidenciada al realizar la técnica ELISA en todos los jabalíes, lo que demuestra la fiabilidad de los resultados obtenidos en ambas técnicas. Aunque en el WB no existe un patrón de reconocimiento homogéneo, destacan una serie de bandas aparentemente homólogas al grupo de bandas referenciadas por otros autores como TSL-1. Para el Ag EBL T1, los pesos moleculares aparentes detectados en estas bandas han sido aproximadamente 75, 72, 62, 52 y 47 kDa. Por su parte, utilizando Ag EBL T3, para estas bandas destacadas se calculan unos pesos moleculares aparentes de 70, 60, 49, 45 y 42 kDa. Dada la precisión de la curva patrón, es posible que ambos grupos de bandas sean en parte homólogos y las diferencias de escasos kDa sean más aparentes que reales en algunos casos. Aparte de este bandeo destacado que aparece en todos los jabalíes, se observan diferentes bandas de evolución heterogénea. La utilización de Ag ES, revela un patrón de reconocimiento antigénico menos numeroso, ya que, al 125 DPI, en la mayoría de los jabalíes, se detecta este grupo de bandas de peso molecular medio. Los sueros de jabalíes abatidos en monterías con una alta reactividad en la técnica ELISA, pero negativos a la digestión de 25 g de tejido muscular, reaccionan frente a diversas bandas antigénicas por WB, en muchos casos con un patrón comparable al observado en los jabalíes de infección experimental, sugiriendo que podrían presentar una respuesta específica frente a Trichinella a pesar de que la infección no es demostrable por métodos directos. De manera general, el bandeo obtenido en la mayoría de los jabalíes abatidos en monterías, tiene bandas en común con el patrón antigénico observado en algunos jabalíes experimentales. Por su parte, el estudio histopatológico revela el cuadro lesional derivado de la parasitación por Trichinella en jabalí, observándose principalmente alteración a nivel de musculatura esquelética. Así, de manera general, el cuadro lesional en los diferentes órganos de estudio (corazón, hígado, pulmón, riñón, bazo, linfonodo e intestino delgado) es ligeramente mayor en los jabalíes infectados por T. spiralis. A nivel muscular (diafragma), el infiltrado celular perilarvario está formado principalmente por linfocitos y células plasmáticas, siendo ligeramente mayor alrededor de las larvas de T. britovi, aspecto que conduce a la presencia de calcificaciones larvarias en algunos jabalíes. De manera general, la respuesta celular disminuye con el paso del tiempo. El estudio epidemiológico se ha realizado sobre diferentes hospedadores en el periodo 2001/2010. Así, una parte importante de este bloque de estudio ha sido la recepción y búsqueda del parásito en zorros. En ellos, se ha detectado una prevalencia del 2,86%. Como músculos de diagnóstico se ha utilizado principalmente flexores-extensores torácicos y se ha digerido una media de 25 g por animal. En estos animales se observa la presencia de T. britovi en mayor proporción que la detectada en cerdos o jabalíes, por lo que constituye su reservorio natural, no obstante, la presencia de T. spiralis en zorros va aumentando ocupando poco a poco el lugar de T. britovi. En el estudio de campo, también se ha realizado una búsqueda del parásito en otros carnívoros y en aves. Estas muestras se han remitido desde el Centro de Recuperación de Fauna Silvestre ¿Los Hornos¿ de Sierra de Fuentes, detectándose una garduña (Martes foina) positiva a T. britovi con una parasitación de 2,72 LPG en miembro torácico y un cárabo común (Strix aluco) con una parasitación de 0,898 LPG en músculo pectoral, en el que no se ha podido identificar la especie de Trichinella involucrada. Por ello, las prevalencias detectadas han sido del 2,63% en mamíferos silvestres (excluyéndose el zorro) y del 0,14% en aves. Además, se han muestreado jabalíes abatidos en monterías, detectándose un total de 13 casos positivos de 3.055 jabalíes analizados (0,43%), determinándose que del 76,92% de los casos se aísla T. spiralis. Para obtener unos datos más completos de los casos positivos a Trichinella en Extremadura, se nos remite desde el Servicio Extremeño de Salud todos los casos positivos detectados por los veterinarios oficiales. Así, sabiendo los jabalíes abatidos y los cerdos sacrificados en los diez años de estudio, se puede establecer una prevalencia del 0,18% en jabalí, del 0,0047% en cerdos de matanza domiciliaria y del 0,00011% en cerdos de matadero. En los dos hospedadores, la especie de Trichinella más presente es T. spiralis, las cargas parasitarias más habituales son las de 1-10 LPG y los músculos más parasitados son el diafragma, el sublingual y el masetero, siendo interesante la importancia de la carga parasitaria detectada en jamón, paleta y lomo de estos jabalíes de infección natural, y la distribución más irregular en los casos de bajas cargas parasitarias. Sólo se han observado infecciones mixtas (T1+T3) en jabalíes (2,3%). La tendencia observada en las especies de Trichinella implicadas conlleva un aumento de los aislados de T. spiralis en relación a T. britovi, quedando esta última muy ligada a zonas de marcado carácter montañoso y silvestre. Se han observado como zonas de mayor prevalencia de la trichinellosis, las comarcas del Valle del Jerte, Sierra de Gata y La Vera, y las comarcas con mayor casuística Las Villuercas, Los Ibores y Monfragüe. En todas estas comarcas, el Plan de Lucha y Control diseñado debe ser muy estricto. Este Plan de Lucha y Control conlleva una serie de actuaciones por parte del consumidor final de carne de cerdo y/o jabalí, cazadores, gestores cinegéticos, ganaderos, veterinarios, administraciones públicas e investigadores. Como objetivo de dicho Plan, subyace la necesidad de una convivencia con el parásito bajo unos niveles de control que impliquen seguridad alimentaria.