• Título:  APLICACIÓN DE LA ESTRATEGIA ONE HEALTH AL ESTUDIO DE PATÓGENOS EMERGENTES CON RELEVANCIA EN CASTILLA Y LEÓN
• Autor:  Ariza Miguel, Jaime
• Universidad:  Universidad de León
• Departamento:  Sanidad animal
• Fecha de Lectura:  18/01/2016
• Programa de doctorado:  Programa Oficial de Doctorado en Medicina, Sanidad y Producción Animal y Ciencia de los Alimentos
• Dirección: 
  • RODRÍGUEZ LAZARO, DAVID (DIRECTOR)
  • HERNÁNDEZ PÉREZ, MARTA (DIRECTOR)
  • RODRÍGUEZ FERRI, ELÍAS FERNANDO (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • POVEDA GUERRERO, JOSÉ BISMARCK (PRESIDENTE)
  • Gutierrez Martín, Cesar Bernardo (SECRETARIO)
  • GONZÁLEZ ZORN, BRUNO (VOCAL)
• Descriptores: 
  • GENETICA MOLECULAR
  • ENFERMEDADES INFECCIOSAS
  • AGENTES PATOGENOS DE LOS ALIMENTOS
  • MICROBIOLOGIA
• Localización:  BIBLIOTECA UNIVERSITARIA SAN ISIDORO
• 214587_807544.pdf
• Resumen:
  Sinopsis El concepto ¿One Health¿ ha resurgido internacionalmente en la última década con el objetivo de abordar la salud y el bienestar desde un marco común. En la actualidad se dan una serie de circunstancias (el aumento exponencial de la población mundial y de la demanda de proteínas de origen animal, la globalización extrema, el transporte y comercio internacionales, entre otras), que actuando de forma sinérgica, hacen que las relaciones entre la salud del hombre, los animales y el medio ambiente sean más estrechas que nunca. Por tanto, la existencia de problemáticas globales requiere de la colaboración inter, multi y transdisciplinar por parte de profesionales, empresas privadas e instituciones gubernamentales con ámbito de trabajo en todas las disciplinas involucradas, con el fin de abordarlas desde un punto de vista integral, que permita el diseño y aplicación de programas de prevención y control eficaces que limiten su impacto. Englobado en este contexto, el propósito de esta Tesis Doctoral es abordar problemas tanto de Salud Pública y Sanidad Animal, como del sector agroalimentario en Castilla y León, estudiando la prevalencia y principales vías de transmisión de cuatro patógenos emergentes que tienen un importante impacto en la economía de la región: las especies del género Mycoplasma involucradas en el síndrome de la agalaxia contagiosa (AC), Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM), Listeria monocytogenes y Francisella tularensis. El estudio de estos patógenos se enmarca dentro de la estrategia One Health, ya que o bien constituyen un problema de seguridad alimentaria, causando una disminución en la disponibilidad de proteínas de origen animal (M. agalactiae y S. aureus), o bien son agentes zoonósicos, contribuyendo además al origen y dispersión de la resistencia a antibióticos (SARM), constituyendo un riesgo para la inocuidad de los alimentos (L. monocytogenes) u originando un peligro de exposición al medio ambiente (F. tularensis). Los estudios realizados a lo largo de este trabajo doctoral han sido publicados en 9 manuscritos, desarrollados a través de la colaboración interdisciplinar entre nuestro instituto de investigación, el Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León (ITACyL), y el Laboratorio Interprofesional Lácteo de Castilla y León (LILCyL), la Facultad de Veterinaria de la Universidad de León, el Laboratorio Regional de Sanidad Animal (LRSA), el Complejo Asistencial Universitario de León (CAULE), el Hospital Clínico Universitario de Valladolid, el Aeropuerto Internacional de Bilbao y la Facultad de Ciencias de los Alimentos e Ingeniería de Galati (Rumanía). La metodología utilizada ha complementado los métodos microbiológicos clásicos con técnicas de epidemiología molecular, con el fin de obtener un valor añadido que permita identificar los factores que, dentro del entorno físico y ambiental, afectan al riesgo de padecer una enfermedad determinada, y que son susceptibles de ser sometidos a una intervención preventiva por parte de las autoridades competentes. Así, la detección molecular de los patógenos se ha realizado mediante sistemas de PCR convencional y PCR a tiempo real, y la caracterización genómica de los mismos, mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), análisis multi-locus de repeticiones en tándem de número variable (MLVA) y tipificación multi-locus de secuencias (MLST). En primer lugar, se investigó la presencia de las cuatro especies del género Mycoplasma causantes del síndrome de la AC y de S. aureus, en explotaciones de ganado ovino de aptitud láctea de Castilla y León. Dentro del marco de la estrategia One Health estos patógenos tienen relevancia en el contexto de la seguridad alimentaria, ya que causan pérdidas importantes en la producción láctea de los rumiantes, siendo unas de sus principales causas de mastitis. La presencia de las cuatro especies de micoplasmas fue estudiada en 597 muestras de leche de los tanques de mezcla de 528 explotaciones, entre julio del 2009 y abril del 2010. M. agalactiae fue la única especie observada, por lo que se continuó con su detección hasta en un total de 1.798 muestras de 1.313 explotaciones localizadas en 12 provincias, 8 de ellas de Castilla y León, del 2008 al 2010. Esta especie fue detectada en todas las provincias estudiadas, con una prevalencia tras el enriquecimiento de las muestras del 36,8% mediante PCR a tiempo real, y del 9,2% por observación microscópica tras el cultivo microbiológico. Por otro lado, la caracterización genómica de 410 aislados de M. agalactiae mediante PFGE, VNTR y MLST, mostró una gran homogeneidad genética, perteneciendo todos ellos al genotipo st-10 por MLVA, y el 92% de los mismos al ST-5 mediante MLST, lo que nos permite confirmar la presencia de una población endémica clonal en nuestro país. Los resultados obtenidos en nuestros estudios en ganado ovino, contrastan con la situación observada en el ganado caprino, en el que se detectaron las cuatro especies del género Mycoplasma, y los aislados de M. agalactiae mostraron una diversidad genética elevada. Por tanto, la AC ovina y caprina cursan con una epidemiología diferente en España. A su vez, la presencia de S. aureus se estudio en 486 de las explotaciones, mostrando una prevalencia del 68,5%, lo que apunta a que ambos patógenos podrían estar causando grandes pérdidas económicas directas e indirectas en el sector ovino de Castilla y León. Asimismo la elevada prevalencia de S. aureus podría tener implicaciones en Salud Pública, ya que frecuentemente porta genes de resistencia a antibióticos, sin olvidar el aspecto de su poder patogénico vinculado a la producción de enterotoxinas, capaces de producir episodios de intoxicaciones alimentarias, aunque ese último aspecto no haya sido tratado en este trabajo. En este sentido, la emergencia de microorganismos con resistencia a antibióticos, constituye actualmente una de las mayores preocupaciones a nivel mundial, debido a su gran impacto socio-económico y a sus implicaciones en materia de Salud Pública, comprometiendo el tratamiento de enfermedades a medio y largo plazo. Por este motivo, este es uno de los tres puntos prioritarios de la alianza OMS-OIE-FAO dentro de la estrategia One Health. En consecuencia, hemos estudiado la presencia de SARM desde una aproximación holística, tanto en el ámbito animal, en las explotaciones de ganado ovino de Castilla y León, como en el clínico, en el CAULE. La presencia de linajes específicos de SARM ha sido demostrada tanto en los animales de producción, como en los productos alimentarios asociados, razón por la que también hemos estudiado el papel de la venta e importación de alimentos de origen animal a la UE desde países extracomunitarios, en la diseminación de SARM. Los clones ST5 y ST125 (CC5-SARM-IV) fueron los más prevalentes (76,5%) en el CAULE durante los años 2007-2008, lo que está en concordancia con otros estudios llevados a cabo a nivel nacional y confirma la presencia de una población endémica clonal en el entorno clínico español. Por otro lado, detectamos por primera vez en España la presencia de un aislado SARM con el gen homólogo mecC en ganado (ovejas), de un total de 601 aislados de S. aureus analizados procedentes de 229 explotaciones (0,4%). Este descubrimiento tiene importantes implicaciones en la Salud Pública, ya que los métodos de rutina que se utilizan en los hospitales para el diagnóstico de SARM fallan en la detección de la variante con el gen mecC, lo que puede derivar en el tratamiento inadecuado de los pacientes y a la subestimación de la prevalencia de SARM en el ámbito hospitalario. Por otro lado, se detectó la presencia de aislados de SARM de linajes asociados a la comunidad (ST8-SARM-IV) y al ganado (ST398-SARM-IV/V), en las muestras decomisadas en el Aeropuerto Internacional de Bilbao, y en un mercado gris en la frontera de Rumanía con la República de Moldavia, lo que demuestra que la importación y la venta ilegal de alimentos a la UE desde países extracomunitarios constituyen rutas de diseminación de microorganismos con resistencia a antibióticos. Otra observación interesante, es que a pesar de que se detectaron linajes asociados al ganado (ST130-SARM-XI y ST398-SARM-IV/V) en las explotaciones de ganado ovino de Castilla y León, así como la introducción en España de aislados comunitarios (ST8-SARM-IV) a través de la importación ilegal de alimentos en vuelos extracomunitarios, ninguno de ellos fueron encontrados en el CAULE. Estos resultados, junto con los obtenidos en otros estudios publicados previamente en el entorno hospitalario español, sugieren que a pesar de la emergencia mundial de estos linajes, su presencia por el momento es infrecuente en los hospitales de nuestro país. Otro aspecto importante en Salud Publica es el concepto de inocuidad alimentaria, que implica que los alimentos tienen que ser seguros para la población. Las enfermedades de transmisión alimentaria representan un gran problema tanto económico, como de Salud Pública. De todas las enfermedades zoonósicas investigadas por la UE, la listeriosis es responsable de los casos más graves, con una tasa de hospitalización y mortalidad del 99,1% y 15,6%, respectivamente. Además, se ha observado por quinto año consecutivo una tendencia en el aumento de los casos en la UE-28, del 9,4% en el 2013 con respecto al año anterior. El estudio de L. monocytogenes es de especial interés en España, puesto que afecta a la Industria de Alimentación y Bebidas, que es el primer sector industrial en facturación del país y un importante generador de empleo, representando el 2,4% del PIB. Además, la listeriosis ha sido incluida como enfermedad de declaración obligatoria (EDO) en nuestro país en 2015. En este trabajo hemos investigado su presencia en el ambiente clínico (CAULE) y en muestras de alimentos de origen animal que están siendo introducidas clandestinamente en nuestro país a través de vuelos internacionales procedentes de países extracomunitarios, con el objetivo de conocer las características fenotípicas y genotípicas de los aislados que están circulando. El estudio de epidemiología molecular de 17 aislados de L. monocytogenes causantes de infecciones invasivas en el CAULE durante un periodo de nueve años (2006-2014), demostró la existencia de un brote de listeriosis en Castilla y León que no había sido detectado con anterioridad, lo que destaca el valor que aportan este tipo de estudios en la detección prematura de brotes de listeriosis y en la localización de su origen, lo que permite limitar su impacto y evitar la dispersión del patógeno. Por otro lado, se detectaron los mismos clones de L. monocytogenes en las muestras de alimentos decomisados a los pasajeros del Aeropuerto de Bilbao, lo que confirma la existencia previamente descrita de un número pequeño de clones prevalentes con distribución mundial. El último patógeno estudiado, F. tularensis, se engloba en el marco de la estrategia One Health, dentro de las zoonosis, como riesgo biológico. La tularemia constituye el ejemplo perfecto de que la salud del hombre, los animales, y el medio ambiente están interconectadas. Este patógeno fue el agente causal de dos de los mayores brotes de tularemia en humanos descritos hasta el momento a nivel mundial, que tuvieron lugar en Castilla y León entre los años 1997-1998 y 2007-2008, afectando en conjunto a más de 1.000 personas. En este trabajo realizamos un estudio de epidemiología molecular desde una aproximación integral, estudiando los clones involucrados en la infección, tanto en los animales como en el hombre. Los resultados corroboraron que ambos brotes fueron causados por el mismo grupo de genotipos relacionados, pertenecientes al subclado B.FTNF002-00, ampliamente distribuido en Europa Central y Occidental. Este dato apunta a que la reemergencia de la tularemia en España en el año 2007, tras 10 años sin actividad epidemiológica, no fue causado por la introducción de cepas exóticas, sino a la persistencia de reservorios locales de infección hasta el momento desconocidos, lo que sugiere la existencia de focos locales de tularemia en nuestra Comunidad Autónoma. Se detectaron los mismos genotipos de Francisella tularensis tipo B en todos los hospedadores estudiados, humanos y animales, por lo que no fue posible establecer qué especie o especies pudieran considerarse en sentido estricto el reservorio fundamental del patógeno en periodos interepidémicos. La aplicación de la estrategia One Health al estudio de patógenos emergentes con relevancia en Castilla y León, tanto para la industria alimentaria como en el ámbito de la Salud Pública y la Sanidad Animal, nos ha permitido extraer conclusiones importantes, que permiten conocer la situación actual de los mismos en nuestra Comunidad Autónoma, ofreciendo información para el diseño y aplicación de estrategias de prevención y control efectivas que permitan evitar la diseminación de los patógenos y limitar su impacto. Estas investigaciones no habrían sido posibles sin la acción coordinada entre instituciones y profesionales de todos los ámbitos implicados, que ha aportado un valor añadido a los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral. Abstract The ¿One Health¿ concept has resurfaced worldwide in the last decade to tackle health and welfare from a common framework. Nowadays, there are a number of circumstances (the exponential increase of the world population and demand for animal protein, extreme globalization, international transportation and trade, among others), that acting synergistically, make relationships between human, animal and environmental health closer than ever. Therefore, the existence of ¿wicked¿ problems requires inter, multi and transdisciplinary collaboration among professionals, private companies and government agencies within the field of work in all disciplines involved, in order to address them using a holistic approach which enables the design and implementation of effective control and prevention programs that limit their impact. Encompassed in that context, the purpose of this Thesis is to address wicked problems of Public and Animal Health, and the food industry in Castile and Leon, studying the prevalence and main routes of transmission of four emerging pathogens that have an important impact on the economy of the region: Mycoplasma spp. involved in the contagious agalactia syndrome (CA), methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Listeria monocytogenes and Francisella tularensis. The study of these pathogens is part of the One Health strategy as they either constitute a problem of food security, causing a decrease in the availability of animal proteins (M. agalactiae and S. aureus), or are zoonotic agents, contributing to the origin and spread of antibiotic resistance (MRSA), or constitute a risk to food safety (L. monocytogenes), or pose a risk of environmental exposure (F. tularensis). Studies along this doctoral work have been published in 9 manuscripts, developed through interdisciplinary collaboration between our research institute, the ¿Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León¿ (ITACyL), and the ¿Laboratorio Interprofesional Lácteo de Castilla y León¿ (LILCyL), the Faculty of Veterinary Medicine of the University of León, the Regional Laboratory of Animal Health (LRSA), the University Hospital of León (CAULE), the University Hospital of Valladolid, the International Airport of Bilbao and the Faculty of Food Science and Engineering in Galati (Romania). Methodology included classical microbiological methods with molecular epidemiology techniques in order to achieve an added value to identify the factors that, in the physical and natural environment, affect the risk of developing a certain disease, and are susceptible to preventive intervention by the competent authorities. Thus, molecular detection of pathogens was performed using conventional and real-time PCR systems, and genomic characterization by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multi-locus variable number of tandem repeats analysis (MLVA) and multi-locus sequence typing (MLST). First, we investigated the presence of the four Mycoplasma spp. causing CA and S. aureus in dairy sheep farms in Castile and Leon. As part of the One Health strategy these pathogens are relevant in the context of food security, since they cause major losses in milk production of ruminants, being one of the main causes of mastitis. The presence of four Mycoplasma spp. was studied in 597 milk samples from the mixing tanks of 528 farms, between July 2009 and April 2010. M. agalactiae was the only species observed, so we continued with its detection up to a total of 1,798 samples of 1,313 farms located in 12 provinces, including 8 of Castile and Leon, from 2008 to 2010. M. agalactiae was detected in all the provinces studied, with a prevalence of 36.8% after enrichment of samples followed by real-time PCR, and 9.2% by microscopic observation after microbiological culture. Furthermore, the genomic characterization of 410 isolates by PFGE, MLST and VNTR showed a high genetic homogeneity, all belonging to genotype st-10 by MLVA and 92% of them to ST-5 by MLST, which confirms the presence of a clonal endemic population in our country. Our results in sheep were in contrast to the situation observed in goats, in which the four Mycoplasma spp. have been detected and M. agalactiae isolates showed high genetic diversity. Therefore, ovine and caprine CA present a different epidemiology in Spain. In turn, the presence of S. aureus was studied in 486 farms, showing a prevalence of 68.5%, which suggests that both pathogens could be causing large direct and indirect economic losses in the sheep sector of Castile and Leon. Furthermore, the high prevalence of S. aureus may have implications for Public Health, since this bacterium often carries antibiotic resistance genes, not to mention its pathogenic power associated with enterotoxin production, capable of producing episodes of food poisoning, although that last point has not been discussed in this work. The emergence of antibiotic resistant microorganisms is a major concern worldwide because of its great socio-economic impact and implications for Public Health, compromising the treatment of diseases in the medium and long term. For this reason, it is one of the three priority issues of WHO-FAO-OIE alliance within the One Health strategy. Accordingly, we studied the presence of MRSA by a holistic approach, in the animal environment, on sheep farms in Castile and Leon, in clinical settings, and in the CAULE. The presence of specific lineages of MRSA has been demonstrated in both food animals and their associated foodstuff. Consequently, we have also studied the role of illegal importation and sale of foods of animal origin to the EU from non-EU countries, in the dissemination of MRSA. ST5 and ST125 (CC5-MRSA-IV) clones were the most prevalent (76.5%) in the CAULE during the years 2007-2008, which is in line with other studies carried out at the national level, and confirms the presence of an endemic clonal population in the Spanish clinical environment. Furthermore, we detected for the first time in Spain the presence of one isolate of MRSA harbouring the homologous gene mecC in livestock (sheep), from a total of 601 S. aureus isolates in 229 farms (0.4%). This discovery has important implications for Public Health, since routine methods used in hospitals for diagnosing MRSA fail to detect the mecC gene, which lead to inappropriate treatment of patients and underestimation of the prevalence of MRSA in hospitals. On the other hand, community-associated and livestock-associated MRSA (CA-MRSA, LA-MRSA) clones (ST8-MRSA-IV and ST398-MRSA-IV/V, respectively) were detected in confiscated samples at the International Airport of Bilbao, and in a ¿grey¿ market in the Romanian border with the Republic of Moldova, which shows that the illegal importation and sale of foods to the EU from non-EU countries are routes of dissemination of antibiotic resistant microorganisms. Another interesting observation is that although LA-MRSA clones (ST130-MRSA-XI and ST398-MRSA-IV/V) were detected in sheep farms in Castile and Leon, as well as the introduction in Spain of CA-MRSA isolates (ST8-MRSA-IV) through illegal food imports in non EU-flights, none of these lineages were detected in the CAULE. These results, along with those obtained in previous studies in the Spanish clinical settings, suggest that despite the global emergence of these lineages, their presence at the moment is uncommon in the hospitals of our country. Another important aspect of Public Health is the concept of food safety, which means that food must be safe for the population. Foodborne diseases are a major economic and Public Health problem worldwide. Of all zoonotic diseases investigated by the EU, listeriosis is responsible for the most serious cases, showing a hospitalization and mortality rate of 99.1% and 15.6%, respectively. Moreover, it has been observed for the fifth consecutive year a trend in the increase of cases in the EU-28, of 9.4% in 2013 over the previous year. The study of L. monocytogenes is of special interest in Spain, since it affects the food and beverage industry, which is the first industrial sector of the country in turnover and an important generator of employment, accounting for 2.4% of GDP. Furthermore, listeriosis has been included as a notifiable disease (EDO) in our country in 2015. In this work, we investigated its presence in the clinical setting (CAULE), and in food samples of animal origin being smuggled into our country through international flights from non-EU countries, to study the phenotypic and genotypic characteristics of isolates that are circulating in our country. The molecular epidemiology study of 17 isolates of L. monocytogenes causing invasive infections in the CAULE for a period of nine years (2006-2014), demonstrated the existence of an outbreak of listeriosis in Castile and Leon that had not been previously detected. This discovery highlights the value of this type of study in the early detection of outbreaks of listeriosis and of its origin, limiting their impact and avoiding the spread of the pathogen. On the other hand, the same clones of L. monocytogenes were observed in food samples confiscated from passengers at Bilbao¿s Airport, which confirms the previously described existence of a small number of prevalent clones with worldwide distribution. The last pathogen which was studied, F. tularensis, is included as part of the One Health strategy within zoonosis, as a biohazard. Tularemia is the perfect example which shows that human, animal and environmental health are closely interconnected. This pathogen was the causative agent of two of the largest human tularemia outbreaks described so far worldwide, which took place in Castile and Leon in 1997-1998 and 2007-2008, affecting altogether over 1,000 people. In this work, we performed a molecular epidemiology study from a comprehensive approach, studying the clones involved in infection in both, animals and humans. The results confirm that both outbreaks were caused by the same group of closely related genotypes belonging to subclade B.FTNF002-00, which is widely distributed in Central and Western Europe. These data suggest that the re-emergence of tularemia in Spain in 2007, after 10 years of epidemiological silence, was not caused by the introduction of an exotic strain, but by the persistence of local reservoirs of infection hitherto unknown, which suggests the existence of local foci of tularemia in our region. The same genotypes of Francisella tularensis type B were detected in all studied hosts, humans and animals, so it was not possible to establish what species might be considered the fundamental reservoir of the pathogen in inter-epidemic periods. The implementation of the One Health strategy to study emerging pathogens with relevance in Castile and Leon, both for the food industry and in the field of Public and Animal Health, has enabled us to draw important conclusions that allow us to understand the current situation in our region, providing information for the design and implementation of effective control and prevention strategies to prevent the spread of pathogens and limit their impact. This research would not have been possible without the coordinated action between institutions and professionals from all areas involved, which has provided an added value to the results obtained in this Thesis.