• Título:  CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTÍPICA DE LA RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN CEPAS DE ESCHERICHIA COLI Y ENTEROCOCCUS SPP. DE ORIGEN ALIMENTARIO
• Autor:  Guerrero Ramos, Emilia
• Universidad:  Universidad de León
• Departamento:  Higiene y tecnología de los alimentos
• Fecha de Lectura:  01/02/2016
• Programa de doctorado:  ESTRATEGIAS PARA LA MEJORA Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL
• Dirección: 
  • ALONSO CALLEJA, CARLOS (DIRECTOR)
  • CAPITA GONZALEZ, ROSA (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • QUINTO FERNÁNDEZ, EMILIANO (PRESIDENTE)
  • Alonso Hernando, Alicia (SECRETARIO)
  • CASTRO ALIJA, MARÍA JOSÉ (VOCAL)
• Descriptores: 
  • MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
  • AGENTES PATOGENOS DE LOS ALIMENTOS
  • ANTIBIOTICOS
  • BIOLOGIA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS
• Localización:  BIBLIOTECA UNIVERSITARIA SAN ISIDORO
• 223149_829986.PDF
• Resumen:
  La disminución de la susceptibilidad bacteriana a antibióticos y biocidas es un problema de importancia creciente en los ámbitos de la Seguridad Alimentaria y la Salud Pública, por lo que el estudio de los factores que influyen en la resistencia a los antibióticos y la tolerancia a los biocidas es de gran interés. El primer objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido determinar si la exposición de Escherichia coli ATCC 12806 a concentraciones subinhibitorias de biocidas de uso alimentario provoca la adaptación de la cepa y comprobar si esta adaptación se asocia con protección cruzada a otros biocidas, a la vez que conocer el papel de las bombas de expulsión y de los cambios de la hidrofobicidad de la superficie celular en la adaptación de la cepa a los compuestos. Para ello, se estimó la adaptación a lo largo del tiempo mediante el estudio de los parámetros de crecimiento (ecuación de Gompertz modificada): fase de latencia, ritmo máximo de crecimiento y densidad celular en la fase estacionaria. Se pretendió asimismo determinar si las bombas de expulsión (en presencia del inhibidor carbonil cianuro m-clorofenilhidrazona -CCCP-) y los cambios en la hidrofobicidad de la superficie celular (ensayo de adhesión microbiana a solventes -MATS-) están asociados con esta adaptación. Las células de E. coli se examinaron antes y después de la adaptación (fosfato trisódico -FTS-, nitrito sódico ¿NS-, hipoclorito sódico -HIP-, sin compuesto -NC-), en ausencia y en presencia de los biocidas (FTS, NS, HIP, NC). Por lo tanto, se ensayaron 16 combinaciones de diferentes condiciones (adaptación y exposición). Después de repetidos pases en medios de cultivo estáticos que contenían concentraciones crecientes subinhibitorias de FTS, NS o HIP, E. coli mostró una tolerancia adaptativa, especialmente al NS y al HIP. El aumento de la tolerancia era estable y se mantuvo después de 7 pases sucesivos en un medio de cultivo libre de biocidas. Se observó adaptación cruzada entre diferentes biocidas (NS e HIP). Tanto las bombas de expulsión como los cambios en la hidrofobicidad de la superficie celular parecen estar asociados con la adaptación al NS y al HIP. Se sugiere que la exposición a dosis subletales de biocidas de uso en la Industria Alimentaria representa un riesgo de desarrollo de adaptación y adaptación cruzada a dichos compuestos. Hay que señalar, sin embargo, que estos datos derivan de ensayos de laboratorio, siendo necesaria la realización de experimentos en condiciones reales para la extracción de conclusiones sólidas. El segundo objetivo ha sido conocer la prevalencia de resistencia a antibióticos en cepas de Enterococcus spp. aisladas de carne de caza en el noroeste de España y determinar la frecuencia de genes de resistencia y de virulencia. Para ello se utilizaron un total de 55 aislamientos de Enterococcus (45 E. faecium, 7 E. faecalis y tres E. durans) procedentes de carne de caza sivestre (corzo, jabalí, conejo de monte, faisán y paloma) en el noroeste de España. Se determinó la susceptibilidad de las cepas frente a un panel de 14 antimicrobianos de importancia clínica utilizando la técnica de difusión por disco. Todas las cepas presentaron un fenotipo de multirresistencia (resistencia a entre tres y 10 antimicrobianos). Las cepas exhibieron elevados porcentajes de resistencia a eritromicina (89,1%), tetraciclina (67,3%), ciprofloxacina (92,7%), nitrofurantoína (67,3%) y quinupristina-dalfopristina (81,8%). Los valores más bajos (9,1%) se observaron para la resistencia de alto nivel a gentamicina, kanamicina y estreptomicina. El número medio de resistencias por cepa fue de 5,8 en el caso de las cepas de E. faecium, 7,9 para E. faecalis y 5,7 para E. durans. Se estudiaron los genes de resistencia a antibióticos y de virulencia utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Un total de 15 (57,7%) de las 26 cepas resistentes a la vancomicina presentaban el gen vanA. Otros genes de resistencia detectados fueron vanB, erm(B) y/o erm(C), tet(L) y/o tet(M), acc(6¿)-aph(2¿¿) y aph(3¿)-IIIa en las cepas resistentes a vancomicina, eritromicina, tetraciclina, gentamicina y kanamicina, respectivamente. Se detectaron los genes específicos del transposon Tn5397 en el 54,8% de los enterococos positivos para el gen tet(M). Se estudiaron nueve factores de virulencia (gelE, agg, ace, cpd, frs, esp, hyl, efaAfs y efaAfm), detectándose todos ellos con la excepción del gen frs. Se encontró al menos un gen de virulencia en el 20,0% de las cepas de E. faecium, 71,4% de E. faecalis y 33,3% de E. durans, siendo los genes ace y cpd los más frecuentes (6 aislamientos cada uno). Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la carne de caza silvestre podría jugar un papel en la diseminación a lo largo de la cadena alimentaria de enterococos con genes de resistencia y de virulencia. Finalmente, se pretendió conocer la prevalencia y los patrones de resistencia a antibióticos de enterococos resistentes a la vancomicina (vancomycin-resistant enterococci, VRE) en preparados de carne de ave, cerdo y vacuno del noroeste de España, determinar la frecuencia de genes de resistencia y de virulencia en dichos aislamientos, conocer la capacidad de las cepas para formar biofilm y estudiar la diversidad genética de las cepas de VRE aisladas mediante su ribotipado. Se examinaron 160 muestras de preparados de carne de ave (80), cerdo (40) y vacuno (40) (salchichas rojas, salchichas blancas, hamburguesas, albóndigas, nuggets, carne picada, escalope y crepes) procedentes de establecimientos de venta al público del noroeste de España para conocer la prevalencia de enterococos resistentes a la vancomicina (vancomycin-resistant enterococci, VRE). Se detectaron cepas de VRE en 38 (23,8%) muestras (37,5% de ave, 15,0% de cerdo y 5,0% de vacuno, respectivamente). Se utilizó una cepa de cada muestra positiva para su posterior caracterización. Los aislamientos se identificaron como Enterococcus faecium (14 cepas), E. durans (10), E. hirae (7), E. gallinarum (5) y E. casseliflavus/E. flavescens (dos). Todas las cepas mostraron resistencia o susceptibilidad intermedia a tres o más antibióticos de importancia clínica, además de a la vancomicina. Se observaron elevadas tasas de resistencia o susceptibilidad intermedia para la teicoplanina (81,6% de los aislamientos), cloranfenicol (81,6%), eritromicina (100%), quinupristina-dalfopristina (89,5%) y ciprofloxacina (81,6%). Se encontraron niveles moderados de resistencia o susceptibilidad intermedia a ampicilina (34,2%) y tetraciclina (36,8%). Se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para estudiar los genes de resistencia a antibióticos y los factores de virulencia. Los genes vanA, vanB, vanC-1 y vanC-2/vanC-3 se identificaron en 27, uno, 5 y dos aislamientos, respectivamente. Otros genes de resistencia o transposones encontrados fueron tet(L), tet(M), Tn5397 (tetraciclina), erm(A), erm(B) (eritromicina), vat(D) y vat(E) (quinupristina-dalfopristina). La mayoría de los aislamientos carecían de determinantes de virulencia (los genes agg, hyl y efaAfm se detectaron en una, una y 5 cepas, respectivamente). Las cepas se clasificaron como no productoras (4 aislamientos) o débiles productoras (34 aislamientos) de biofilm (ensayo con cristal violeta). El análisis de cluster (ribotipado, EcoRI) puso de manifiesto una fuerte relación genética entre cepas procedentes de diferentes tipos de preparados cárnicos, especies animales y establecimientos de venta. Este estudio sugiere que los preparados cárnicos podrían jugar un importante papel en la transmisión al hombre de VRE con diferentes genes de resistencia y de virulencia.