• Título:  CARACTERIZACIÓN CITOGENÉTICA DE BIVALVOS VENEROIDEOS Y ALGUNOS DE SUS PARÁSITOS
• Autor:  Garcia-Souto Garcia-Souto, Daniel
• Universidad:  Universidad de Vigo
• Departamento:  Bioquímica, genética e inmunología
• Fecha de Lectura:  14/07/2017
• Mención Europeo / Mención Internacional: concedido
• Programa de doctorado:  Programa Oficial de Doctorado en Metodología y Aplicaciones en Ciencias de la Vida
• Dirección: 
  • Pasantes Ludeña, Juan José (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • CABRERO HURTADO, JOSEFA (PRESIDENTE)
  • MARTÍNEZ CAMACHO, JUAN PEDRO (SECRETARIO)
  • Chaves, Raquel (VOCAL)
• Descriptores: 
  • CITOGENETICA ANIMAL
  • CITOGENETICA
• Resumen:
  Los bivalvos son un grupo de moluscos exclusivamente acuícolas caracterizados por presentar un cuerpo comprimido lateralmente cuyas partes blandas están recubiertas por una concha (Gosling 2015). Las más de 8000 especies aceptadas en la actualidad según el World Register of Marine Species (WoRMS, http://www.marinespecies.org/) se distribuyen por todo el planeta ocupando ecosistemas tanto marinos como salobres y, en menor medida, de agua dulce. Los bivalvos incluyen un buen número de especies de gran interés económico y juegan un papel ecológico fundamental en ambientes bentónicos. Los bivalvos son, además, hospedadores intermediarios de digeneos parásitos, que pueden llegar a tener un enorme impacto en poblaciones, tanto naturales como de cultivo, de bivalvos. Si bien la clasificación de los bivalvos es un tema bastante controvertido, análisis filogenéticos recientes (Bieler et al. 2014) proponen la existencia de seis linajes monofiléticos en la clase Bivalvia Protobranchia, Pteriomorphia, Paleoheterodonta, Archiheterodonta, Anomalodesmata e Imparidentia, constituyendo las cuatro últimas lo que tradicionalmente se conocía como subclase Heterodonta. La subclase Imparidentia incluye más de dos tercios de los bivalvos actuales y es extremadamente diversa en cuanto a forma, tamaño, anatomía y hábitos de vida y las filogenias moleculares más recientes han constatado que algunos de los órdenes, superfamilias y familias incluidos en ella son grupos para o polifiléticos (Bieler et al. 2014). Debido a ello, su taxonomía está en continua revisión. Un buen ejemplo de esta situación es el tradicional orden Veneroida que en la actualidad ya no se considera ni morfológicamente homogéneo ni monofilético y, por tanto, es cuestionado a pesar de su enorme importancia pues engloba algunas de las familias con mayor número de especies descritas (Veneridae, 680 especies; Mactridae, 180; Donacidae, 100; Tellinidae, 500) (Huber 2010, 2015). La mayoría de los estudios cromosómicos en bivalvos se limitan a la descripción del número cromosómico y el cariotipo organizado en función de la morfología y el tamaño de los pares cromosómicos (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994). Los análisis de este tipo realizados a lo largo del pasado siglo llevaron a proponer que los números cromosómicos eran relativamente estables dentro de cada familia de bivalvos y que se agrupaban en torno a los 2n = 20 habituales en Ostreidae, los 2n = 28 de Mytilidae y Pteridae y los 2n = 38 de la mayoría de las restantes familias, incluida Veneridae (Thiriot-Quiévreux 1994). No obstante, el incremento en el número de especies analizadas ha demostrado que algunas familias y géneros de bivalvos presentan especies con distintos números cromosómicos. Esto no parece ser el caso en la subclase Imparidentia puesto que la inmensa mayoría de las especies analizadas son 2n = 38. Además, los cariotipos de estas especies suelen presentar cromosomas en los que morfología y tamaño muestran escasas diferencias (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994, 2002). Esta homogeneidad dificulta la identificación de pares cromosómicos concretos y hace que las homologías cromosómicas interespecíficas descritas sean una suposición. Así pues, a fin de comparar los cariotipos de bivalvos en general y de veneroideos en particular, es necesario explorar otras metodologías, entre ellas las técnicas de bandeo cromosómico o la hibridación in situ fluorescente (FISH). En bivalvos se han mapeado mediante FISH genes rRNA 45S en unas 50 especies, genes rRNA 5S en unas 25, genes de las histonas del núcleo en 15, genes de las histonas de unión en seis y secuencias teloméricas en unas 25 (Thiriot-Quiévreux 2002; Leitão y Chaves 2008; Petrovi¿ et al. 2009; Pérez-García et al. 2010a, 2010b, 2011, 2014a, 2014b; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al. 2011; González-Tizón et al. 2013; Li et al. 2016; García-Souto et al. 2017). Estas técnicas han posibilitado el establecimiento de cariotipos más fiables y una mejor comprensión de los cambios cromosómicos que han acompañado su evolución (Pérez-García et al. 2014b) pero también han contribuido a entender mejor sus filogenias. Además, la aplicación de estas técnicas en especies de estas familias ha permitido comprobar que frente a la presunta conservación cariotípica que se deducía tras aplicar técnicas citogenéticas clásicas, la situación cromosómica de estas secuencias puede presentar variaciones considerables. Por ejemplo, las especies atlánticas de ostras se diferencia de sus congéneres pacíficas por la posición de los genes rRNA 45S, demostrando que incluso cariotipos aparentemente muy conservados muestran divergencias (Wang et al. 2004). A estos mismos grupos se refiere la mayoría de las localizaciones cromosómicas de DNA satélites en bivalvos (Clabby et al. 1996; Wang et al. 2001; Martínez-Lage et al. 2002; Cross et al. 2005; Odierna et al. 2006; Biscotti et al. 2007; Bouilly et al. 2008; López-Flores et al. 2010; Hu et al. 2011; Petraccioli et al. 2015). En Imparidentia la aplicación de técnicas de mapeo cromosómico es todavía más escasa. Hasta la fecha se han localizado mediante FISH los genes rRNA 45S en 18 especies, los genes rRNA 5S en 9, los genes de las histonas del núcleo en 2 y secuencias teloméricas en 12 (Insua et al 1999; González-Tizón et al. 2000; Wang y Guo 2001, 2007, 2008; Martínez et al. 2002; Plohl et al. 2002; Fernández-Tajes et al. 2003, 2008; Hurtado y Pasantes 2005; Petrovi¿ et al. 2009; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al. 2011; González-Tizón et al. 2013; Pérez-García et al. 2014a). Casi todas estas especies son 2n = 38 y sus cariotipos relativamente similares pero presentan considerables diferencias en la distribución cromosómica de estas secuencias, demostrando, por tanto, su interés como marcadores para deducir relaciones de parentesco evolutivo. Por lo que se refiere a ADN satélites, las únicas especies de la subclase Imparidentia en las que se han localizado este tipo de secuencias son la almeja fina, Ruditapes philippinarum (Passamonti et al. 1998) y la coquina, Donax trunculus (Petrovi¿ et al. 2009). Si los estudios citogenéticos en bivalvos son escasos, todavía lo son mucho más en trematodos digeneos. Pese a ser el grupo mayoritario de metazoos endoparásitos con más de 18000 especies, sólo se han descrito números cromosómicos y cariotipos en unas 300 y se han localizado mediante FISH secuencias teloméricas y/o genes de los rRNA 45S en 9 (Hirai et al. 1989, 2000; Baršiené 1993; Hirai y Lo Verde 1996; Bell et al. 1998; Petkevi¿i¿t¿ et al. 2003; Špakulová y Casanova 2004; Reblánová et al. 2011; Zadesenets et al. 2012a, 2012b; Petkevi¿i¿t¿ et al. 2012, 2014, 2015; Hirai 2014; Sofi et al. 2015). Por ello, para incrementar el conocimiento citogenética en especies de Veneroida y de algunos de los trematodos digeneos que las parasitan, analizamos los cromosomas de 20 especies de Veneridae (Ruditapes philippinarum, R. decussatus, Venerupis corrugata, Clausinella fasciata, Chamelea gallina, C. striatula, Venus verrucosa, Venus casina, Dosinia exoleta, Dosinia lupinus and Petricola litophaga), Mactridae (Spisula subtruncata, S. solida and Mactra stultorum), Donacidae (Donax trunculus and D. vittatus) y Tellinidae (Bosemprella incarnata, Macomangulus tenuis, Moerella donacina and Serratina serrata) y de 10 taxones de parásitos digeneos, Bucephalus minimus, B. australis, Prosorhynchoides carvajali (Bucephaloidea), Monascus filiformis (Gymnophalloidea), Parorchis acanthus (Echinostomatoidea), Cryptocotyle lingua (Opisthorchioidea), Cercaria longicaudata, Monorchis parvus (Monorchioidea), Diphterostomum brusinae y Bacciger bacciger (Microphalloidea) aislados a partir de 12 moluscos que actúan como huéspedes intermedios. La aproximación general consistió en aplicar diversas combinaciones de fluorocromos base-específicos (4¿-6-diamidino-2-phenylindol DAPI, DNA rico en AT; cromomicina A3, CMA, DNA rico en GC) e inespecíficos (ioduro de propidio, PI), bandas C e inmunodetección de 5-methyl-cytosine además de mapear sondas de DNA repetido (rDNA 45S y 5S, genes de histonas, secuencias telomericas y DNA satélites) sobre sus cromosomas. Se obtuvieron preparaciones cromosómicas utilizando métodos previamente publicados (Méndez et al. 1990; Pasantes et al. 1990). Después de tratar los bivalvos con colchicina, se diseccionaron branquias y gónadas y se sumergieron en agua de mar al 50% y al 25% antes de fijarlas en una mezcla de etanol y ácido acético. Las paralarvas de digeneos fueron tratadas del mismo modo. En ambos casos las muestras ya fijadas fueron desagregadas en una disolución de ácido acético al 60% hasta obtener suspensiones celulares que se dejaron caer gota a gota sobre portaobjetos precalentados a 50 °C. La tinción con fluorocromos se llevó a cabo tal y como describen Pérez-García et al. (2010b). Después de controlar su calidad mediante microscopía de contraste de fases (Nikon), las preparaciones fueron teñidas con CMA (0.25 mg/mL), contrateñidas con DAPI (0.14 ¿g/mL), lavadas en agua corriente, se dejaron secar al aire y se montaron (Vectashield, Vector). Las preparaciones se estudiaron y fotografiaron mediante microscopía de fluorescencia (Nikon Eclipse-800). Se tomaron imágenes separadas para cada fluorocromo con una cámara CCD DS-Qi1Mc (Nikon) controlada con el programa NIS-Elements (Nikon). La superposición de las imágenes se realizó con Adobe Photoshop. Tras ser fotografiadas, las preparaciones se retiñeron con una combinación de DAPI y PI (0.07 ¿g /mL), se lavaron en agua corriente, se dejaron secar al aire, se montaron y se volvieron a fotografiar. La extracción de DNA se realizó mediante cloroformo/isoamilalcohol o con el EZNA Mollusc DNA Kit (OMEGA). En los casos necesarios se amplificaron por PCR fragmentos del gen COI mitocondrial usando los cebdores LCO1490 y HCO2198 (Folmer et al. 1994). Para amplificar un fragmento del gen rRNA 16S mitocondrial se usaron los cebadores 16L29 (Schubart et al. 2001) y 16SBr (Palumbi 1996). El segmento ITS2 del rDNA 45S se amplificó con los cebadores ITS3 e ITS4 (White et al. 1990). Para su uso como sondas FISH, se utilizaron los cebadores universales LR10R y LR12 (Vilgalys lab website, http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm) para amplificar un fragmento del 28S rDNA. Para amplificar el 5S rDNA y el gen de la histona H3 se usaron los cebadores descritos por Pérez-García et al. (2010a, 2010b) y por Giribet y Distel (2003), respectivamente. Las secuencias de DNA se amplificaron (GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems) en volúmenes de 50 µL que contenían 125 ng de DNA genómico, 50¿¿M de cada dNTP, 50 ¿M de cada cebador, 1x tampón de PCR, 15 ¿M de MgCl2 y 5 U de JumpStart¿ Taq DNA Polymerase (Sigma). Las amplificaciones incluyeron una desnaturalización inicial a 95 ºC (2 min), 35 ciclos de amplificación y una extensión final a 72 °C (5 min). Las secuencias amplificadas fueron purificadas (FavorPrepTM GEL/PCR Purification Kit, Favorgen) y secuenciadas (CACTI, Universidad de Vigo) en ambos sentidos en un ABI PRISM 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) usando un BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Las secuencias se editaron con BioEdit v. 7.1.11 (Hall 1999) y se alinearon con Muscle usando los parámetros por defecto en MEGA7 (Kumar et al. 2016). Se realizaron búsquedas de secuencias con el algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), disponible en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Se empleó el algoritmo MegaBLAST, con parámetros por defecto, para comparar las secuencias con las existentes en las bases de datos del NCBI y del Barcode of Life Data System (BOLD). Los cromosomas se hibridaron con sondas de rDNA 5S y 28S y de genes de la histona H3 (Pérez-García et al. 2011). La sondas 28S rDNA se marcaron con biotina-16-dUTP (Roche Applied Science) o digoxigenina-11-dUTP (10x DIG Labeling Mix, Roche Applied Science) usando un kit de nick translation (Roche Applied Science). Las sondas para el gen de la histona H3 y para el rDNA se marcaron directamente por PCR con biotina-16-dUTP (20 ¿M) o digoxigenina-11-dUTP (5 ¿M). Las preparaciones recibieron tratamientos con RNasa y pepsina, se desnaturalizaron (70 ºC, 2 min) y se hibridaron a 37 ºC. La biotina fue detectada con avidina conjugada con isotiaocianato de fluoresceína (FITC) y anti-avidina biotinilada (Vector). La digoxigenina se detectó con anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC) (Sigma). Una vez contrateñidas con DAPI, se montaron y se examinaron al microscopio. Se tomaron imágenes para cada fluorocromo por separado, se seudocolorearon y se superpusieron de la manera indicada más arriba. También se realizaron experimentos FISH utilizando una sonda telomérica (C3TA2)3 péptido nucleica (PNA) (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo indicado por el suministrador. Se realizaron análisis cromosómicos y cariotipicos sobre un mínimo de 10 ejemplares por especie (5 machos, 5 hembras). Para cada especie, se construyeron cariotipos a partir de un mínimo de 10 metafases completas con señales de FISH y se midieron en ellas las longitudes de los brazos cromosómicos. A partir de estos datos se calcularon longitudes relativas e índices centroméricos. En concordancia con datos previos, todas las especies aquí estudiadas poseen 2n = 38 y sus cariotipos suelen estar formados por cromosomas que muestran una distribución de longitudes cuasi continua. En 16 de las 20 especies las regiones ricas en GC coincidieron con los NORs pero las cuatro restantes, Donax trunculus, D. vittatus, Mactra stultorum y Spisula subtruncata, presentaron bandas intercalares adicionales. Además, se identificó un nuevo DNA satélite como el componente principal de la heterocromatina rica en GC de S. subtruncata. Como predice la library hypothesis, este DNA satélite también fue detectado en M. stultorum y S. solida, mostrando en ellas una gran conservación de la secuencia pero una drástica reducción en el número de copias. Se determinó también el grado de metilación de este satélite mediante secuenciación genómica con bisulfito e inmunodetección de 5-metil-citosina y los resultados se compararon con los detectados mediante polimorfismos de amplificación sensible a la metilación (MSAP) y ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). La metilación del satélite fue alta para lo habitual en bivalvos y triplicó la media de metilación del genoma de S. subtruncata. En relación al mapeo mediante FISH, los patrones de distribución de las agrupaciones de genes de la histona H3, del rDNA 5S y del rDNA 45S en especies de Veneroida presentaron algunas peculiaridades. En la familia Veneridae se identificaron un total de 18 loci para las agrupaciones de genes de histona H3 en las 11 especies analizadas. En seis de las especies apareció una única agrupación mientras que Chamelea striatula presentó cuatro y las cuatro especies restantes dos. Quince de estos loci son subterminales, dos intercalares y el restante subcentromérico. Excepto Chamelea striatula todas estas especies presentaron una única agrupación 45S rDNA. Por el contrario, para el 5S rDNA sólo apareció una única localización en cinco especies, dos en otras cinco especies y tres en la restante, Petricola litophaga. Las señales aparecieron en cromosomas distintos salvo en Clausinella fasciata y Chamelea striatula en las que un único par era portador de agrupaciones de genes de histonas y de rDNA, y Ruditapes decussatus con señales 5S rDNA y 45S rDNA solapantes. El número y la localización de estas agrupaciones, unido al análisis de las secuencias nucleotídicas de fragmentos del gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa (COI) y del rDNA 16S mitocondriales y el espaciador interno transcrito 2 (ITS2) del rDNA 45S nuclear, permitió determinar el estatus taxonómico de las chirlas Chamelea gallina y C. striatula. La comparación de ejemplares procedentes de cuatro poblaciones atlánticas y mediterráneas mostró claras diferencias entre ellas. La constancia en la distribución de las agrupaciones rDNA 5S y la variabilidad en las del rDNA 45S y de los genes de histonas en C. gallina y C. striatula fueron de una magnitud similar a las de Venus casina y V. verrucosa y las de Dosinia exoleta y D. lupinus. Al contrario, aunque se detectaron pequeñas diferencias intraespecíficas tanto en C. gallina como en C. striatula éstas fueron mucho menores que entre taxones y similares a las mostradas por otras especies de bivalvos. La comparación de las secuencias nucleotídicas confirmó que estos taxones son especies diferentes. En Mactridae las agrupaciones 45S rDNA son subterminales en las tres especies. Tanto Spisula solida como Mactra stultorum presentaron dos agrupaciones para el 45S rDNA en los brazos cortos de los pares 17 and 19 y en los brazos largos de los pares 3 y 4, respectivamente. La única agrupación encontrada en Spisula subtruncata se encuentra en el brazo largo del par 18. Las tres mactras presentan una única agrupación 5S rDNA, subterminal en el brazo corto del par 5 en Spisula solida y en el brazo largo del par 3 en Spisula subtruncata, e intercalar en el brazo corto del par 15 en Mactra stultorum. A pesar de que también hay una única agrupación de genes de histona H3 en las tres especies, sus localizaciones difieren, intercalar en el brazo largo del par subtelocéntrico 8 en Spisula solida y del 12 en Mactra stultorum pero subcentromerico en el brazo largo del par metacentrico 14 en Spisula subtruncata. Las coquinas presentaron agrupaciones de genes de la histona H3 intercalares en el brazo largo del par 17, subtelocentrico en D. trunculus y telocentrico en D. vittatus. El rDNA 45S es intercalar en el brazo corto del par 6, subtelocéntrico en D. trunculus. La mayoría de los ejemplares de D. vittatus presentan el rDNAs 45S en el brzo corto del par 6 que en este caso es telocéntrico. Por el contrario, el rDNA 45S es subcentromerico en el brazo largo del par 6, metacéntrico, en todos los especímenes de D. vittatus recolectados en Samil. El número de agrupaciones rDNA 5S es diferente en D. trunculus y D. vittatus. En ambas especies hay una agrupación subterminal en el brazo largo del par subtelocéntrico 10 pero D. trunculus presenta también una segunda agrupacion en el brazo corto del par metacéntrico 2. Las diferencias cariotípicas pudieran ser fundamentalmente debidas a inversiones pericéntricas. Como en las otras familias, las telinas también presentaron diferencias en número y localización de las agrupaciones rDNA 45S, rDNA 5S y de genes de la histona H3. Macomangulus tenuis, Moerella donacina y Bosemprella incarnata portan un único rDNA 45S mientras que Serratina serrata presenta dos. Con respecto al rDNA 5S, también aparecen especies con una (B. incarnata and S. serrata) o dos (M. tenuis and M. donacina) agrupaciones. Por el contrario, las cuatro especies muestran una única agrupación de genes de la histona H3, aunque situados en lugares diferentes. En las especies de tremátodos digeneos estudiadas, los números diploides variaron desde un mínimo de 2n = 12 en B. bacciger a un máximo de 2n = 22 en P. acanthus. Estos parásitos también mostraron grandes diferencias en la morfología de sus cromosomas. Mientras que los cariotipos de C. lingua y P. acanthus se componen de cromosomas exclusivamente metacéntricos y subtelocéntricos, respectivamente, el resto de los taxones presentó diversas combinaciones de tipos cromosómicos. Todas las especies presentaron una única agrupación del rDNAs 45S y otra del 5S aunque la localización fue diferente. En B. minimus and P. acanthus ambos rDNAs aparecen en pares cromosómicos distintos mientras que en las restantes especies las señales solapan en un único par. Los experimentos mediante FISH también permitieron probar la existencia de regiones DAPI negativas, muy descondensadas, coincidentes con el rDNA 45S. Las señales para el 45S rDNA aparecen en la cromatina condensada que flanquea esas regiones y que no son verdaderos telómeros pues carecen de señales teloméricas. La presencia de regiones subcentroméricas de ese tipo en B. australis, P. carvajali, P. acanthus, C. lingua, M. parvus, y B. bacciger, provoca que una tinción sencilla con DAPI diese números cromosómicos aparentemente superiores a la dotación diploide. En los taxones restantes, B. minimus, M. filiformis, C. longicaudata y D. brusinae, muchas de las metafases mitóticas mostraron constricciones secundarias claramente DAPI negativas que separaban un pequeño fragmento de cromatina del resto del cromosoma. En este estudio también se detectaron de 1 a 19 cromosomas B en los ejemplares de B. bacciger aislados de Ruditapes decussatus. Estos cromosomas metacéntricos supernumerarios presentan señales teloméricas en ambos extremos y se caracterizan por mostrar brazos largos fuertemente teñidos con DAPI, evidentes también en los núcleos interfásicos.