• Título:  RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS Y CAPACIDAD PARA FORMAR BIOFILM EN CEPAS DE MRSA (STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A LA METICILINA) Y SALMONELLA DE ORIGEN ALIMENTARIO
• Autor:  BUZÓN DURÁN, LAURA
• Universidad:  Universidad de León
• Departamento:  Higiene y tecnología de los alimentos
• Fecha de Lectura:  22/09/2017
• Programa de doctorado:  Programa Oficial de Doctorado en Medicina, Sanidad y Producción Animal y Ciencia de los Alimentos
• Dirección: 
  • ALONSO CALLEJA, CARLOS (DIRECTOR)
  • CAPITA GONZALEZ, ROSA (DIRECTOR)
• Tribunal: 
  • ESTEVES, ALEXANDRA (PRESIDENTE)
  • RIESCO PELAEZ, FELIX (SECRETARIO)
  • Guerrero Ramos, Emilia (VOCAL)
• Descriptores: 
  • MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
  • BACTERIOLOGIA
  • ANTIBIOTICOS
• Localización:  BIBLIOTECA UNIVERSITARIA SAN ISIDORO
• Resumen:
  La resistencia bacteriana a los antibióticos se ha convertido en un problema creciente de Salud Pública en el ámbito mundial. Por otro lado, las películas bacterianas o biofilms han adquirido un papel protagonista en la Industria Alimentaria, al incrementar el riesgo de contaminación de los alimentos con microorganismos patógenos y alterantes. Así, los biofilms se han relacionado con numerosos brotes de enfermedades transmitidas por alimentos y con importantes pérdidas económicas para el Sector Alimentario. En algunos estudios previos se ha demostrado que el uso de biocidas a concentraciones subinhibitorias puede incrementar la capacidad de las bacterias para formar biofilm, pero hasta el momento no se habían ensayado las cepas (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina ¿MRSA- y Salmonella enterica serotipo Typhimurium) y desinfectantes (cloruro de benzalconio, fosfato trisódico e hipoclorito sódico) empleados en este trabajo. El primer objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido conocer la calidad microbiológica de diferentes preparados de carne de ave crudos adquiridos en establecimientos de venta al público de la ciudad de León (España) y determinar el perfil de resistencia a antibióticos de las cepas de Staphylococcus aureus aisladas de dichos alimentos. Para ello, se determinaron los niveles microbianos (microbiota aerobia viable -MAV-, microorganismos psicrotrofos, enterobacterias, coliformes fecales, enterococos, Pseudomonas, Pseudomonas fluorescentes, el grupo de mohos y levaduras y Staphylococcus aureus) en carne picada, hamburguesas, nuggets, salchichas blancas, salchichas rojas, escalope y rollitos. Los aislamientos de S. aureus se ensayaron para determinar su susceptibilidad a 20 antimicrobianos de importancia en medicina humana y en veterinaria (método de difusión por disco, CLSI). La carga microbiana media (log10 ufc/g) osciló entre 2,63 ± 0,80 (enterococos) y 6,66 ± 1,09 (psicrotrofos). Los recuentos medios de MAV (6,44 ± 1,16 log10 ufc/g) se consideraron aceptables en base a los criterios microbiológicos de la Unión Europea. El tipo de producto influyó (P < 0,05) en los recuentos microbianos, presentando las muestras de escalope los niveles más elevados para la mayoría de los grupos microbianos. Dos tercios (66,7%) de las muestras estaban contaminadas con S. aureus. Todos los aislamientos de S. aureus fueron multirresistentes (a entre tres y quince antimicrobianos). La mayor prevalencia de resistencia se observó para ampicilina, oxacilina, penicilina G, ceftazidima y ácido nalidíxico. Los resultados de este trabajo pusieron de manifiesto que los preparados de carne de ave presentan una elevada carga microbiana y son un reservorio importante de cepas de S. aureus resistentes a antibióticos. Dichos hallazgos enfatizan la necesidad de una correcta manipulación de estos alimentos para reducir el riesgo para el consumidor. Los estafilococos resistentes a la meticilina (methicillin-resistant staphylococci; MRS) son un importante problema para la Salud Pública y la Sanidad Animal. El segundo objetivo de la Tesis consistió en determinar los patrones de resistencia a antibióticos de cepas de MRS aisladas de preparados cárnicos y evaluar el sistema Sensi Test Gram-positive para determinar la resistencia a antibióticos de dichas cepas, comparando los resultados del método de difusión por disco y del test miniaturizado. Para ello, se estudió la susceptibilidad de 30 cepas de MRS (Staphylococcus aureus, S. cohnii, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lentus, S. lugdunensis, S. sciuri y S. xylosus) procedentes de preparados cárnicos (de mamíferos y aves) frente a 11 antimicrobianos de importancia clínica pertenecientes a siete grupos diferentes. Se emplearon dos métodos: la técnica estándar de difusión por disco en placas de agar Mueller-Hinton y un sistema miniaturizado disponible comercialmente (Sensi Test Gram-positive). Un hallazgo destacable es que 16 cepas (53,3% del total) exhibieron un fenotipo de resistencia de espectro extendido (extensively drug-resistant phenotype; XDR). El número medio de resistencias por cepa fue de 4,67. Estos resultados sugieren que los preparados cárnicos adquiridos en establecimientos de venta al público son un vehículo probable de transmisión de cepas de MRS con resistencias múltiples. La resistencia a la eritromicina fue la más frecuentemente detectada (76,7% de las cepas), seguida por la resistencia a la tobramicina, ceftazidima (66,7%), ciprofloxacina (56,7%) y fosfomicina (53,3%). Se encontró una concordancia (coeficiente kappa) del 64% entre los dos métodos comparados. Considerando el método de difusión por disco como la técnica de referencia, la sensibilidad, especificidad y eficiencia de la prueba miniaturizada fueron del 98,44%, 69,64% y 83,33%, respectivamente. La mayor parte de las discrepancias entre los dos métodos se debieron a aislamientos que resultaron susceptibles empleando la técnica estándar y resistentes con el método miniaturizado (falsos positivos). Estos resultados sugieren que el sistema miniaturizado puede ser útil para predecir la resistencia a varios antimicrobianos en cepas MRS de origen cárnico, debido a su muy alta sensibilidad, lo cual indica que el test subestima mínimamente las resistencias a antibióticos. El tercer objetivo de la Tesis Doctoral fue investigar el efecto de concentraciones subinhibitorias de tres biocidas (cloruro de benzalconio -CB-, fosfato trisódico -FTS- e hipoclorito sódico -HIP-) sobre la arquitectura y viabilidad de los biofilms formados por una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) de origen alimentario. Tras la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs) de los biocidas (CB, FTS e HIP) se procedió a la exposición de las cepas a concentraciones crecientes subinhibitorias de los compuestos y a la determinación de la tolerancia adaptativa y de la estabilidad de dicha tolerancia, observándose ésta únicamente para el HIP. Para el estudio de los biofilms, se examinaron las imágenes por medio de microscopía láser confocal de barrido (confocal laser scanning microscopy, CLSM) tras la tinción con SYTO9 y yoduro de propidio. Las concentraciones subinhibitorias de CB o FTS redujeron la capacidad de MRSA para formar biofilms. En cambio, la presencia de concentraciones subinhibitorias de HIP mejoró la habilidad de MRSA para producir biofilms cuando las células habían sufrido una adaptación previa a este compuesto (para biofilms formados en presencia de HIP, el biovolumen en el campo observado -14.161 µm2- fue de 137.785,31 ± 47.682,79 µm3; en ausencia de biocidas fue de 70.204,13 ± 31.603,98 µm3; P ¿ 0,05). Se observó la mayor cantidad de células vivas (fluorescencia verde) en los biofilms que crecieron en presencia de HIP en relación al resto de condiciones probadas (58.999,75 ± 55.312,37 µm3 vs 31.976,29 ± 38.594,98 µm3; P ¿ 0,05). En este trabajo se puso de manifiesto por primera vez que la presencia de HIP en concentraciones subinhibitorias induce la formación de biofilms por MRSA. Dichos resultados sugieren que el uso repetido de hipoclorito sódico a bajas concentraciones puede representar un peligro para la Seguridad Alimentaria y la Salud Pública, puesto que los niveles de HIP que potencian la formación de biofilm pueden estar presentes, en determinadas condiciones, tanto en los entornos alimentarios como en el sistema sanitario. El último objetivo de la Tesis Doctoral ha sido investigar el efecto de concentraciones inferiores a la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de tres biocidas de uso en las industrias alimentarias (CB, FTS e HIP) en las biopelículas formadas por Salmonella. Se estudiaron, mediante CLSM, tras tinción con SYTO9 y yoduro de propidio, los parámetros estructurales y la viabilidad de los biofilms formados por una cepa de Salmonella enterica serotipo Typhimurium aislada de carne de ave. Las CMIs de Salmonella antes de la exposición a concentraciones subinhibitorias de los biocidas fueron de 8,0 µg/ml (CB), 18,0 mg/ml (FTS) y 6,0 mg/ml (HIP). Los cultivos presentaron una tolerancia adquirida estable frente al CB y al HIP. Las concentraciones máximas de biocidas que permitieron el crecimiento bacteriano tras la exposición a concentraciones crecientes subinhibitorias de los compuestos fueron 30,4 µg/ml (CB) y 10,1 mg/ml (HIP). La arquitectura y viabilidad de los biofilms de S. Typhimurium variaron en función de la exposición previa a concentraciones subinhibitorias de los diferentes compuestos. La adaptación previa a HIP incrementó (P < 0,001) la formación de biofilm (biovolumen medio en el campo observado 139.856,15 ± 155.213,27 µm3) en relación con las células no expuestas (53.779,05 ± 55.535,62 µm3) y las previamente expuestas a CB (58.216,97 ± 58.644,45 µm3) o FTS (30.052,13 ± 28.290,56 µm3). Este hecho fue particularmente marcado cuando los biofilms se formaron en ausencia de biocidas o en presencia de concentraciones subinhibitorias de HIP. Los biofilms formados por los cultivos previamente expuestos a FTS presentaron mayor porcentaje de células muertas que el resto de cultivos (34,08 ± 13,74% vs 23,70 ± 16,16%; P < 0,001). Los resultados de este trabajo enfatizan la importancia de mantener concentraciones de HIP superiores a la CMI durante los procesos de limpieza y desinfección en las industrias de alimentos para reducir el riesgo de salmonelosis de origen alimentario asociadas a biofilms.