• Título:  MICROBIOTA DIGESTIVA DEL CERDO: DETERMINACIÓN DEL PATRÓN EN CONDICIONES DE SALUD Y ENFERMEDAD SWINE GUT MICROBIOTA: COMPOSITION AND DIVERSITY IN HEALTHY AND DISEASED ANIMALS
• Autor:  Miranda Hevia, Rubén
• Universidad:  Universidad de León
• Departamento:  Sanidad animal
• Fecha de Lectura:  30/11/2018
• Mención Europeo / Mención Internacional: concedido
• Programa de doctorado:  Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias y de los Alimentos por la Universidad de León
• Dirección: 
  • RUBIO NISTAL, PEDRO MIGUEL (DIRECTOR)
  • CARVAJAL URUEÑA, ANA MARÍA (CODIRECTOR)
  • RUBIO NISTAL, PEDRO MIGUEL (TUTOR/PONENTE)
• Tribunal: 
  • GARRIDO PAVON, JUAN JOSE (PRESIDENTE)
  • GUEIMONDE FERNÁNDEZ, MIGUEL (SECRETARIO)
  • GARCÍA MANZANILLA , EDGAR (VOCAL)
• Descriptores: 
  • PORCINOS
  • PATOLOGIA VETERINARIA
  • MICROBIOLOGIA VETERINARIA
• Localización:  BIBLIOTECA UNIVERSITARIA DE SAN ISIDORO
• Resumen:
  La microbiota digestiva tiene un gran impacto en la salud de los animales participando en diversas funciones fisiológicas. En los últimos años, en el ganado porcino han cobrado especial relevancia los problemas digestivos no específicos asociados a las alteraciones de esta microbiota denominadas disbiosis. Por otra parte, el control de las infecciones digestivas en el cerdo se basa, fundamentalmente, en el empleo de antimicrobianos aunque la legislación es cada vez más restrictiva respecto a su uso con fines profilácticos o metafilácticos. Por este motivo es necesario desarrollar nuevas opciones terapéuticas como los cambios en la dieta, ácidos orgánicos, el empleo de extractos vegetales o de pro y prebióticos que modifiquen, restauren o corrijan los desequilibrios de la microbiota intestinal. Sin embargo, antes de aplicar estas nuevas estrategias de control es necesario ampliar el conocimiento sobre la microbiota intestinal y desarrollar herramientas que permitan valorar su composición en condiciones de campo de forma sistemática y eficaz. El objetivo del presente trabajo ha sido el estudio de la microbiota digestiva del cerdo durante las primeras semanas de vida en animales sanos y con problemas digestivos asociados a disbiosis para avanzar en el desarrollo y evaluación de nuevas intervenciones para el control de estos procesos o en la reducción del empleo de antimicrobianos. La técnica elegida para el estudio de la composición y evolución de la microbiota intestinal fue la PCR cuantitativa o PCRc, un método más rápido y económico que la secuenciación masiva del ADN de la microbiota. Se cuantificaron las poblaciones de bacterias totales, bacteroides, lactobacilos, enterobacterias, bifidobacterias y clostridios de los clúster I, IV y XIV en un total de doce estudios experimentales que abarcaron las etapas de lactación, destete, transición y primera mitad de cebo. Además, se desarrolló y optimizó una técnica ELISA para la cuantificación de lactoferrina, un biomarcador de inflamación intestinal, en las heces de los lechones. La comparación de los resultados proporcionados por las PCRc desarrolladas en esta Tesis con los de la secuenciación masiva basada en la amplificación del ARNr 16S, técnica de referencia para el estudio de la microbiota digestiva, demostró una alta correlación entre las estimaciones obtenidas por ambas técnicas. El seguimiento longitudinal de la microbiota de los lechones, desde el nacimiento hasta el periodo de cebo, evidenció un incremento progresivo de bacteroides, una disminución de lactobacilos y enterobacterias, aunque éstas se elevaron ligeramente en el destete, y concentraciones relativamente estables de bifidobacterias y de los tres clúster de clostridios, aunque los clúster IV y XIV presentaron una concentración inferior durante los primeros días de vida. La comparación entre lechones sanos y lechones con signos clínicos compatibles con disbiosis permitió demostrar diferencias significativas. La microbiota de los lechones sanos presentó un número inferior de enterobacterias y mayores concentraciones de lactobacilos y clostridios del clúster IV y XIV. Sin embargo, la concentración de lactoferrina en las heces fue similar en ambos grupos de animales, por lo que no se pudo demostrar la existencia de inflamación intestinal asociada a esta disbiosis. Se observaron escasas diferencias en la composición de la microbiota en lechones con la misma genética y alimentación pero estabulados en granjas con diferente estatus sanitario. Los lechones de las granjas con un estatus alto presentaron una mejor microbiota al nacimiento mientras que los animales de las granjas de estatus sanitario bajo presentaron, a lo largo de todo el seguimiento, una menor diversidad en su microbiota, hecho que ha sido asociado a una mayor receptividad a las infecciones. Finalmente, se evaluaron diferentes intervenciones en la dieta. El empleo de óxido de zinc en lechones destetados redujo las enterobacterias presentes en las heces, disminuyendo, por tanto, el riesgo de diarreas posdestete. La reducción del uso de antibióticos en la dieta tuvo un efecto limitado en la composición bacteriana de la microbiota, destacando tan solo la reducción de la concentración de bacteroides. La adición de ácidos grasos de cadena media se relacionó con un aumento significativo de bacteroides y clostridios del clúster IV y XIV, microorganismos, a su vez, productores de ácidos grasos de cadena corta, mientras que el incremento de la fibra en la dieta mediante la administración de avena no incrementó la riqueza de la microbiota, contrariamente a lo propuesto en otros estudios, y se asoció a una reducción de los clostridios del clúster IV en uno de los estudios. Gut microbiota has a great impact on animal health participating in several physiological functions. In recent years, non-specific digestive diseases associated with dysbiosis or microbial imbalance of this microbiota have gained significant relevance in swine. Moreover, the control of the most common swine digestive infections is mainly based on the use of antimicrobials, although the legislation is increasingly restrictive regarding its use for prophylactic or metaphylactic purposes. For this reason, there is an urgent need to develop new therapeutic approaches such as changes in the diet or supplementing it with organic acids, plant extracts or probiotics and prebiotics which modify, restore or correct imbalances of this gut microbiota. However, before the implementation of these new control strategies, it will be necessary to expand our knowledge on the swine gut microbiota and to develop tools that will allow the evaluation of its composition in field conditions in a systematic and efficient way. This study focuses on the characterization of gut microbiota in swine during the first weeks of life in both healthy and diseased animals suffering from digestive disorders associated with dysbiosis as well as the animals receiving different diets. The final aim is to advance in the development and evaluation of new interventions for the control of enteric disorders avoiding the use of antimicrobials in swine production. Quantitative PCR or qPCR was the chosen technique for the study of the composition and evolution of gut microbiota, a faster and more economical method than the massive sequencing of the microbiota DNA. Populations of total bacteria, bacteroides, lactobacilli, enterobacteria, bifidobacteria and Clostridium clusters I, IV and XIV were quantified in twelve experimental studies which included lactation, weaning, nursing and the first half of the fattening period. An ELISA for the quantification of lactoferrin, a biomarker of intestinal inflammation, was also developed and optimized in piglet faeces. The comparison of the results given by the qPCR assays and those of the massive sequencing based on the amplification of the 16S rRNA, gold-standard for the study of gut microbiota, showed a high correlation between the estimates obtained using both techniques. Monitoring of gut microbiota from birth to the fattening period showed a progressive increase in bacteroides and a decrease in lactobacilli and enterobacteria, although this latter population was slightly higher at weaning. Populations of bifidobacteria and the three Clostridium clusters remained relatively stable throughout the follow-up period, although Clostridium clusters IV and XIV showed a lower concentration during the first few days of life. The comparison between healthy and diseased piglets with clinical signs compatible with dysbiosis detected several significant differences. Gut microbiota of the healthy piglets showed lower numbers of enterobacteria and higher concentrations of lactobacilli and Clostridium clusters IV and XIV. However, lactoferrin concentration in faeces was similar in both groups of animals, with no evidence of intestinal inflammation. There were also limited differences in the composition of gut microbiota in piglets sharing genetics and diet but reared on farms with different healthy standards. Piglets from farms with a high health standard presented a better microbiota composition at birth while piglets from low standard farms showed, throughout the follow-up, a lower diversity in their microbiota, a fact that has been associated with a greater susceptibility to infections. Finally, different diet interventions were evaluated. The supplementation with zinc oxide reduced enterobacteria population in the faeces of weaned piglets and thus decreasing the risk of post-weaning diarrhoea. The reduction of antibiotics in the diet had a limited effect on the bacterial composition of gut microbiota, with lower numbers of bacteroides. The addition of medium chain fatty acids was associated with a significant increase of bacteroides and Clostridium clusters IV and XIV, microorganisms which produce short chain fatty acids, while the increase of fiber in the diet through the supplementation with oatmeal did not increase the richness of the microbiota, the opposite to that previously proposed, and was associated with a reduction in the population of Clostridium cluster IV in one of our experimental studies.