• Título:  BASE CELULAR Y OPTIMIZACIÓN DE LA SUPERVIVENCIA DE LA CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMA DE TORO
• Autor:  Albu-Mohammed, Amer
• Universidad:  Universidad de León
• Departamento:  Biología molecular
• Fecha de Lectura:  18/09/2020
• Programa de doctorado:  Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biotecnología por la Universidad de León
• Dirección: 
  • MARTÍNEZ PASTOR, FELIPE (DIRECTOR)
  • CAAMAÑO GUALDONI, NESTOR (CODIRECTOR)
• Tribunal: 
  • HERRAEZ ORTEGA, PAZ (PRESIDENTE)
  • ÁLVAREZ RODRÍGUEZ, MANUEL (SECRETARIO)
  • OLEGARIO ORDÓÑEZ, CARLOS HIDALGO (VOCAL)
• Descriptores: 
  • BIOLOGIA MOLECULAR
  • BIOLOGIA CELULAR
  • REPRODUCCION ANIMAL
  • PRODUCCION ANIMAL
• Localización:  BIBLIOTECA UNIVERSITARIA DE SAN ISIDORO
• Resumen:
  El sector de la agricultura (bioeconomía) es responsable de producir los alimentos necesarios para la supervivencia diaria de nuestra sociedad. El ganado proporciona gran parte de las proteínas y grasas consumidas en el mundo, en forma de carne y productos lácteos. En este contexto, la inseminación artificial con semen criopreservado (IASC) es una herramienta indispensable en el manejo del ganado en todo el mundo. Aunque los protocolos para la criopreservación seminal en toros están bien establecidos, se requieren más investigaciones y mejoras para resolver varios problemas que causan una disminución en la calidad del semen y en su fertilidad después de la descongelación. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas y el avance en los conocimientos básicos de la biología espermática para mejorar los resultados de la IASC. La necesidad de estas biotecnologías es incluso más relevante para las razas autóctonas o raras. Estas razas son esenciales para las sociedades en las que están presentes, pero hay una especial falta de investigación para mejorar la eficiencia reproductiva de estas razas. Por lo tanto, mientras el objetivo principal de esta tesis es mejorar los protocolos de crioconservación para el semen de toro, en varios experimentos, utilizamos toros de Asturiana de los Valles, una raza de ganado autóctono español (Asturias, España) y también toros de la raza Holstein. La extensión del tiempo de equilibrio puede mantener o mejorar la calidad del semen del toro después de la descongelación, y esto puede depender del diluyente de congelación del semen. Por lo tanto, el primer objetivo en este estudio fue evaluar el impacto de extender el tiempo de equilibrado de 4 h a 24 h utilizando los diluyentes BIOXcell (en colaboración con SERIDA) y OPTIXcell (en colaboración con Xenética Fontao, Lugo) sobre la calidad del semen de toro después de la descongelación. El experimento en SERIDA también incluyó la adición de 2 mM de GSH al diluyente de congelación de semen. Se utilizaron dos razas de ganado, Holstein-Friesian y la raza autóctona Asturiana de los Valles (Asturias, España). La extensión del tiempo de equilibrado en ambos diluyentes redujo la motilidad de los espermatozoides después de la descongelación, aunque mejoró su viabilidad. Sin embargo, las diferencias fueron pequeñas. GSH redujo ligeramente el superóxido mitocondrial. En estos experimentos y en los siguientes, utilizamos CASA para evaluar la motilidad de los espermatozoides y los parámetros cinemáticos, mientras que utilizamos la citometría de flujo para evaluar los parámetros fisiológicos de los espermatozoides (viabilidad, apoptosis, estado de capacitación, daño acrosómico, actividad mitocondrial, producción de especies de oxígeno reactivo citoplasmático (ROS), producción de mitocondriales O2¿ -,% DFI y % HDS). En la mayoría de los experimentos, el semen se evaluó directamente después de la descongelación y después de cuatro o cinco horas de incubación. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) aumentan debido al proceso de criopreservación del semen. Las ROS pueden causar un agotamiento de los antioxidantes endógenos en los espermatozoides y el plasma seminal. Esto puede exponer a los espermatozoides al estrés oxidativo y reducir la calidad y fertilidad del semen después de la descongelación. Por lo tanto, el segundo y tercer objetivo de esta tesis fueron complementar el diluyente de congelación BIOXcell con diferentes concentraciones de trehalosa y los antioxidantes GSH, curcumina y crocina para mejorar la criopreservación del semen de toro y la calidad del semen después de la descongelación, utilizando semen de los toros de las razas Holstein-Friesian y Asturiana de los Valles. En un primer experimento, suplementamos el diluyente de congelación BIOXcell con trehalosa (50 y 100 mM) y GSH (2 y 5 mM). Los resultados mostraron una reducción en la calidad del semen después de la descongelación cuando BIOXcell se suplementó con trehalosa a 50 mM y, especialmente, 100 mM. La trehalosa resultó en un ligero efecto antioxidante, reduciendo ROS. GSH a ambas concentraciones disminuyó la producción del anión superóxido mitocondrial. Sin embargo, GSH no mejoró la calidad del esperma después de la descongelación. En un segundo experimento, suplementamos BIOXcell con curcumina (0.05 y 0.1 mM), crocina (0.5 y 1.5 mM) y GSH (0.5 mM). La curcumina y la crocina no mejoraron la calidad del semen después de la descongelación. Curiosamente, ambas concentraciones de curcumina aumentaron la producción de ROS citoplasmáticos, mientras que la crocina condujo a una disminución de algunos parámetros fisiológicos de los espermatozoides. GSH redujo la producción del anión superóxido mitocondrial sin mejorar la calidad general del esperma. Nuestro cuarto objetivo fue probar el efecto de la centrifugación en coloide de capa única (SLC) y de capa doble (DLC), aplicado en precongelación, en semen de toro para mejorar la calidad tras la descongelación. Se utilizó el coloide comercial BoviPure con este fin y el experimento se realizó con semen de toros de la raza Holstein-Friesian en Xenética Fontao. Los resultados confirmaron que tanto el SLC previo a la congelación como el DLC mejoraron la motilidad y los parámetros fisiológicos de los espermatozoides después de la descongelación, con resultados similares. También redujeron la fragmentación del DNA espermático. Con base en los diversos experimentos de esta tesis, concluimos que la extensión del tiempo de equilibrado de 4 a 24 horas usando BIOXcell u OPTIXcell resultó en pequeñas diferencias con respecto a la calidad del semen de toro después de la descongelación. La suplementación previa a la congelación de BIOXcell con trehalosa redujo la calidad del semen de toro después de la descongelación, mientras que con GSH no mejoró la calidad. La suplementación del diluyente BIOXcell previa a la congelación con curcumina y crocina redujo la calidad del semen después de la descongelación. La realización en precongelación de DGC (como SLC o DLC) con BoviPure mejoró la calidad del semen de toro después de la descongelación.