• Título:  APLICACIÓN DE LA DETECCIÓN AMBIENTAL DEL CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2 MEDIANTE EL USO DE LA PCR CUANTITATIVA EN EL ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE LA INFECCIÓN
• Autor:  López Lorenzo, Gonzalo
• Universidad:  Universidad de Santiago de Compostela
• Departamento:  Escuela de Doctorado Internacional (EDIUS)
• Fecha de Lectura:  02/12/2021
• Programa de doctorado:  Programa de Doctorado en Medicina y Sanidad Veterinaria por la Universidad de Santiago de Compostela
• Dirección: 
  • Fernández Rodríguez, Gonzalo (DIRECTOR)
  • Díaz Cao, José Manuel (CODIRECTOR)
• Tribunal: 
  • Ramis Vidal, Manuel Guillermo (PRESIDENTE)
  • Castillo Rodríguez, Cristina (SECRETARIO)
  • CARVAJAL URUEÑA, ANA MARÍA (VOCAL)
• Descriptores: 
  • CIENCIAS VETERINARIAS
  • PORCINOS
  • VIROLOGIA VETERINARIA
• Localización:  BIBLIOTECA XERAL USC
• 604977_1383586.pdf
• Resumen:
  El Circovirus Porcino Tipo 2 (PCV2) es un virus no envuelto formado por una cadena simple de ADN. Este virus presenta una alta resistencia ambiental que hace que pueda ser infectivo para potenciales hospedadores durante un largo período de tiempo. El PCV2 presenta una gran especificidad de hospedador, siendo los cerdos y los jabalíes sus hospedadores naturales y los únicos animales que pueden desarrollar una enfermedad asociada a esta infección. Los cuadros clínicos asociados a esta infección son variados y pueden consistir en: infecciones subclínicas (PCV2-SI), enfermedad reproductiva (PCV2-RD), síndrome de Dermatitis y Nefropatía porcina (PDNS) y la Enfermedad Sistémica por PCV2 (PCV2-SD). La aparición y desarrollo de cualquiera de estos procesos está influenciado por diferentes factores, tales como la virulencia del genotipo vírico, estado inmunitario del hospedador y concurrencia de coinfecciones o las pautas de manejo llevadas a cabo en las granjas. La distribución de la infección por PCV2 es global. En condiciones naturales, los cerdos se infectan a partir de los 2 ¿ 3 meses de vida cuando han perdido su inmunidad maternal. La principal forma de transmisión es la horizontal. El virus se elimina por diferentes excreciones, siendo la vía fecal-oral la principal forma de contagio. La transmisión es muy eficiente extendiéndose rápidamente a través de la granja. Así, en condiciones sin vacunación se pueden llegar a observar seroprevalencias cercanas al 100 % a final de la etapa de cebo. La transmisión vertical también es posible, aunque de forma limitada. La vacunación frente a PCV2 es esencial para el control de la infección y en la actualidad prácticamente todos los cerdos son vacunados frente al virus. La vacunación se aplica habitualmente a las 3 ¿ 4 semanas de vida de los lechones y es capaz de proteger contra la infección hasta el último tercio de la fase de cebo. El uso de las vacunas ha conseguido reducir significativamente la prevalencia de infección. No obstante los intentos por lograr una posible erradicación no han sido exitosos. Uno de los pilares de los sistemas de control es la vigilancia y monitorización de las granjas. De forma habitual, esto se realiza mediante la toma de muestras de sangre de los animales. Sin embargo, la vacunación masiva ha hecho que la prevalencia de infección en granjas vacunadas se encuentre normalmente en valores reducidos, aumentando el número necesario de animales a muestrear para detectar la infección, y por tanto los costes de los planes de control. Esto ha motivado la búsqueda de sistemas de muestreo alternativos que reduzcan los costes. En este sentido, la toma de muestras de superficies y de aire han mostrado ser alternativas muy eficientes para la detección de algunas enfermedades en especies de producción, al minimizar las muestras necesarias para detectar la infección en un colectivo. Dado que el PCV2 puede resistir largos períodos de tiempo en el ambiente, este tipo de muestras podría ser muy interesante para la detección de PCV2. Sin embargo, su aplicación al control de PCV2 es muy limitada. De este modo, en este trabajo nos hemos propuesto analizar la presencia y distribución del virus en el ambiente de las granjas y evaluar la utilidad de las muestras de superficies y aire para la detección de PCV2 en diversos escenarios epidemiológicos. En el primer estudio de esta Tesis Doctoral se pretendió determinar la posible presencia de ADN de PCV2 en muestras de diferentes superficies, fómites y operarios de granjas con PCV2-SD, PCV2-SI y de granjas que vacunan a los lechones (PCV2-VAC) para valorar sus posibles implicaciones en la epidemiología y el control de la infección por PCV2. Para ello, se seleccionaron nueve granjas con diferente situación epidemiológica: una granja con PCV2-SD, cuatro con PCV2-SI y cuatro con pauta de vacunación frente a PCV2 mantenida durante 7-8 años. Mediante la técnica del hisopado se tomaron muestras de superficies y elementos en diferentes instalaciones de estas granjas: las salas de partos, de transición, de gestación, los almacenes, las oficinas y el perímetro, así como de los operarios de dichas granjas. Los hisopos se eluyeron y se extrajo el ADN, el cual se analizó mediante PCR cuantitativa (qPCR) de PCV2 para detectar y cuantificar la cantidad de dicho virus. En todas las granjas incluidas en el estudio se detectó ADN de PCV2 en las muestras del ambiente, aunque en una proporción estadísticamente diferente dependiendo del estado epidemiológico de la infección en dichas granjas. Así, en la granja con PCV2-SD el porcentaje de muestras ambientales positivas alcanzó el 83,87 %, mientras que en las granjas con PCV2-SI osciló entre el 13,89 % y el 51,28 %, y en las vacunadas entre el 2,63 % y el 32,43 %. Las muestras de la granja con PCV2-SD presentaron un número de copias significativamente mayor que las granjas con PCV2-SI. A su vez, las granjas con PCV2-SI presentaron recuentos mayores que las granjas con PCV2-VAC. Estos resultados muestran que la carga ambiental de PCV2 es mayor a medida que se agrava la enfermedad. En la granja con PCV2-SD se detectó ADN de PCV2 en todas las dependencias, con una proporción de muestras positivas y carga vírica similar en todas ellas. Estos resultados indican que el PCV2 puede estar circulando por todos los grupos de cerdos en granjas con PCV2-SD. Además, la elevada carga ambiental de PCV2 expone a los lechones al virus ya desde una edad muy temprana, lo que facilita su infección. Por tanto, en las granjas con PCV2-SD, además de la vacunación, es muy importante la implementación de medidas encaminadas a reducir la presencia del virus en el ambiente ya que su persistencia en las superficies podría reducir la eficacia de los programas de vacunación. En el conjunto de granjas con PCV2-SI, la mayor carga ambiental de PCV2 se detectó en las salas de transición. De forma llamativa no se detectaron diferencias significativas entre esta dependencia con la carga detectada en los almacenes y las oficinas a pesar de la ausencia de contacto directo de estas salas con los animales. Asimismo, tampoco se detectaron diferencias significativas con las muestras recogidas de los operarios. No obstante, se observó una tendencia decreciente en la carga vírica a medida que las dependencias se encontraron más alejadas de los animales y por tanto con un contacto con los cerdos que podría ser más esporádico. En cambio, en las salas de partos y de gestación la presencia del virus fue prácticamente nula y se limitó a una muestra positiva del pasillo de las salas de partos en una granja. La ausencia general de virus en estas zonas muestra que la circulación de este virus en granjas con PCV2-SI parece limitarse a los cerdos de transición. Los resultados positivos en operarios y utensilios de manejo sugieren que estos elementos podrían actuar como difusores del virus desde las salas de transición a otras dependencias de las granjas. De esta forma, se recomienda la aplicación de medidas que limiten esa diseminación e incluir a los almacenes, las oficinas, y sus elementos en los programas de limpieza y desinfección. En las granjas con vacunación de lechones no se detectó ADN de PCV2 en el ambiente de las salas de transición, pero sí en las salas de gestación de una de las granjas. Estos resultados sugieren que, en una situación de vacunación de lechones, la atención al control de la infección por PCV2 se debe centrar más en las cerdas reproductoras. Además, las dependencias más frecuentemente contaminadas fueron las oficinas, seguidas por las muestras ambientales tomadas a los operarios, en el perímetro de la granja y en los almacenes. De este modo, en este trabajo se comprueba que el PCV2 se puede detectar en superficies de las granjas incluso cuando éstas pueden llevar varios años vacunando. La presencia ambiental del virus podría ser un motivo de los fallos de los programas de erradicación. Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de incluir la detección y monitorización ambiental del PCV2 en los programas de control y erradicación, siendo especialmente importante controlar la posible presencia del virus en almacenes, oficinas y en el perímetro de las granjas. Además, este trabajo también muestra que la distribución ambiental del PCV2 en las granjas de producción es diferente según su estado sanitario. En consecuencia, las principales medidas de control a implementar también deberán ser diferentes. Por último es importante destacar que la importancia relativa de los operarios de las granjas se incrementa a medida que se avanza en el control sanitario de la infección por PCV2, pues ellos serán los responsables de la aplicación de las diferentes medidas de control. En el segundo estudio de esta Tesis Doctoral se evaluó muestreo del aire y de las superficies de las granjas de cebo como una herramienta alternativa al muestreo de un número representativo de cerdos y la detección de su viremia de PCV2. Además, se estudió el efecto de la vacunación en la excreción de PCV2 a través de la detección y cuantificación del virus en el ambiente de las granjas. Para ello se monitorizaron tres bandas de cebo (dos con cerdos vacunados y una sin vacunar frente a PCV2) procedentes de la misma granja de producción. Cada una se alojó en un cebadero y en cada una se tomaron muestras de sangre de 60 ¿ 65 cerdos, seis muestras de aire (dos a ras de suelo, dos a media altura y dos a dos metros de altura); y cinco muestras de superficies (pasillo, tabique, comedero, pared y suelo de cuadras) cuando los animales tenían 10, 12, 14, 16 y 18 semanas de vida. Las muestras de sangre se organizaron en pools de cinco cerdos. A partir de cada uno de éstos, y de cada muestra de aire y de superficie se hizo una extracción de ADN, el cual a continuación se analizó mediante qPCR para detectar y cuantificar la cantidad de ADN de PCV2. En las tres bandas de cebo se detectó viremia de PCV2, aunque en la banda sin vacunar (Control) se detectó antes que en ambos grupos vacunados (12 semanas de vida vs 14 y 18 semanas). La viremia y la prevalencia estimada de infección siempre fueron mayores en el Grupo Control que en los dos grupos vacunados a la misma edad. En cuanto a las muestras de aire, el virus también se detectó en las tres granjas, encontrándose antes en el Grupo Control (10 semanas de vida) que en los vacunados (12 y 18 semanas de vida en cada grupo), y la carga vírica fue 103 veces mayor en el Grupo Control, excepto en el último muestreo, en el cual fue similar en todos los grupos. Respecto a las superficies de la granja, los resultados siguieron la misma línea: el PCV2 se detectó en las tres granjas, pero de nuevo de forma más temprana en el Grupo Control (10 semanas de vida) que en los grupos vacunados (12 y 16 semanas de vida en cada uno). Las técnicas de detección ambiental permitieron detectar el PCV2 de forma más precoz que el análisis de la viremia mediante el muestreo de un número representativo de cerdos. En los tres grupos se detectó el PCV2 en superficies con anterioridad a la detección de viremia. Con las muestras de aire la situación fue similar, siendo de nuevo la detección más precoz en dos de los tres grupos. Además, se observó una buena y significativa correlación entre el promedio de copias de PCV2 detectadas en las muestras de aire y de superficies con la viremia en la población de cerdos (¿= 0,672 y ¿= 0,746 para el aire y las superficies, respectivamente, p < 0,001 en ambos casos). Concretamente, las muestras de aire a ras de suelo y a media altura, así como las muestras de los comederos y las paredes de los corrales presentan la mejor correlación con la viremia en los cerdos. Los resultados de este trabajo muestran que los muestreos de aire y de superficies de las granjas constituyen una alternativa válida y eficaz para la cuantificación de la viremia de PCV2, permitiendo además una detección más precoz. Así, su introducción en los programas de control de PCV2 puede ser beneficiosa y contribuir a la mejora de los mismos. Por otro lado, la baja contaminación ambiental detectada en las granjas vacunadas también nos sugiere que la vacunación no solamente resulta beneficiosa por la protección que confiere, sino también porque contribuye a minimizar la contaminación ambiental posiblemente debido a que produce una reducción y retraso de la excreción viral. Finalmente, en el tercer estudio de la presente Tesis Doctoral se aplicó la detección ambiental de PCV2 para valorar la eficacia de los equipos de protección individual (EPI) que se utilizan habitualmente durante las visitas a las granjas de cebo, como una forma de evaluar el nivel de bioseguridad que se mantiene durante dichas visitas. Para ello, se simuló una visita a una granja de cerdos con presencia confirmada de PCV2. Se establecieron dos grupos de tres visitantes. El primer grupo utilizó EPI certificados (Grupo EPI Certificado): buzos y calzas con protección certificada frente a agentes infecciosos y partículas sólidas y resistentes a la punción y a la tracción. Las buzos se colocaron sobre la ropa de calle y las calzas sobre unos cubrezapatos y el calzado de calle. Los tres componentes de este grupo llevaron la capucha colocada en todo momento. El otro grupo (Grupo EPI Convencional) colocó sobre esos mismos buzos certificados otros convencionales y, en vez de utilizar calzas certificadas, solamente utilizó unas calzas convencionales sobre los cubrezapatos y el calzado de calle. En este caso, los visitantes no utilizaron la capucha. Los visitantes de ambos grupos no tuvieron contacto en ningún momento con los cerdos. Antes de entrar a la granja, y tras finalizar la visita, se utilizó el método del hisopado para tomar muestras del pelo, los buzos externos e internos (o ropa de calle), calzas, cubrezapatos y calzado de calle. Además, se tomaron tres muestras ambientales de los pasillos de la granja y de la pared de los corrales. Todas las muestras se procesaron de igual modo que en los estudios anteriores para detectar y cuantificar la presencia de PCV2. Se confirmó la ausencia de ADN de PCV2 en las muestras control tomadas a los EPI y al pelo antes de entrar a la granja. No obstante, al salir el 43,75 % de las muestras del Grupo EPI Certificado fueron positivas, mientras que en el Grupo EPI convencional este porcentaje alcanzó el 72,22 %. Las protecciones más externas (calzas y buzos) se contaminaron con PCV2 en los seis visitantes, en cantidades similares en los dos grupos y ligeramente inferior a la cuantificada en las muestras del pasillo y de las paredes de los corrales. Del mismo modo, también se detectó en el pelo de un visitante del grupo que no llevaba puesta la capucha. Respecto a los elementos colocados inmediatamente bajo los buzos externos, se detectó ADN de PCV2 en un visitante de cada grupo, a pesar de no apreciar daños en los buzos externos. No obstante, en los elementos del calzado se observó un comportamiento diferente entre los dos grupos. Mientras que en el Grupo EPI Certificado no se observó PCV2 en los elementos bajo las calzas, en el Grupo EPI Convencional sí se detectó ADN vírico en los cubrezapatos de los tres visitantes, y en dos muestras de su calzado de calle. La cantidad de PCV2 en estos cubrezapatos fue mayor que la cuantificada en las calzas en contacto directo con el suelo de la granja. Estos resultados señalan la contaminación con PCV2 durante las visitas a las granjas infectadas incluso sin contacto con los cerdos. Así, en este estudio se ha comprobado que las calzas y buzos convencionales utilizados en las visitas a las granjas de cerdos no son eficaces para evitar la contaminación de los elementos situados bajo ellos, siendo recomendable su sustitución por EPI certificados o bien por el uso de ropa de uso exclusivo y proporcionada por la granja. La detección de ADN vírico debajo de los EPI certificados en un visitante probablemente es debida a una contaminación durante su retirada. Esto señala la necesidad de un protocolo adecuado para el uso de estos elementos, de modo que se evite la contaminación accidental de la ropa y el calzado.