Tesis doctorales: TESEO

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Ministerio de Educación, Cultura y Deporte - Gobierno de España

Título: POLYMER-DRUG CONJUGATES AS PLATFORMS FOR COMBINATION THERAPY IN THE TREATMENT OF HORMONE-DEPENDENT BREAST CANCER
Autor: deladriere, coralie
Universidad: Universitat de València (Estudi General)
Departamento: Bioquímica y biología molecular
Fecha de Lectura: 17/10/2013
Programa de doctorado: Bioquímica Clinicomédica e Inmunología
Dirección:
- VICENT DOCON, MARIA JESÚS (Director)
- LUCAS DOMINGUEZ, RUT (Codirector)
Tribunal:
- Duncan, Ruth (presidente)
- MARTÍNEZ DE LA FUENTE, JESÚS (secretario)
- Fernandez Megia, Eduardo (vocal)
Descriptores:
- QUIMICA ORGANICA
- ANALISIS DE POLIMEROS
- ONCOLOGIA CLINICA
Localización: BIBLIOTECA DEL CAMPUS DE BURJASSOT (UNIVERSITAT DE VALÈNCIA)
Marcador: https://www.educacion.es/teseo/mostrarRef.do?ref=1051917Añadir a favoritos.
Resumen:
1. Objetivos de la Investigación. Los conjugados poliméricos son nanoconstrucciones multicomponente presentes actualmente en clínica como terapia anticancerígena, tanto como agentes únicos, como formando parte de combinaciones. Estos nanoconjugados tienen el potencial de mejorar farmacológicamente el tratamiento de tumores sólidos, debido a una acumulación pasiva en el tumor (efecto `EPR¿) y a un diferente mecanismo de internalización celular y posterior liberación del fármaco(s). La transferencia de conjugados polímero-proteína a uso clínico rutinario, y el desarrollo clínico de conjugados polímero-fármaco anticancerígeno sitúa a los conjugados poliméricos como una de las primeras clases de nanomedicinas con potencial terapéutico antitumoral ya demostrado. La experiencia obtenida con los primeros nanoconjugados en clínica, ha proporcionado las bases para el desarrollo de polímeros conjugados más sofisticados de segunda generación con propiedades terapéuticas mejoradas. El desarrollo de nuevos portadores poliméricos biodegradables con propiedades mejoradas, la utilización de terapia de combinación o el diseño de conjugados dirigidos a nuevas dianas moleculares son algunas de las aproximaciones a seguir para conseguir conjugados más específicos y efectivos considerados de segunda generación. La propiedad de multivalencia que poseen los polímeros nos permite la conjugación de varios compuestos activos en el mismo esqueleto polimérico, la combinación del modulador activo con un citotóxico, otra sustancia activa o un residuo dirigente puede aumentar marcadamente el valor terapéutico de estas macromoléculas. En este sentido, el punto de partida de la presente propuesta es un nuevo concepto establecido por nosotros en 2005 con el desarrollo de HPMA copolimero-AGM-Dox, basado en la terapia de combinación (terapia endocrina + quimioterapia dentro de la misma matriz polimérica) para el tratamiento de cáncer de mama hormono-dependiente (Vicente et al., 2005). El valor terapéutico de esta nueva estrategia ha sido previamente demostrado en modelos celulares, lo que implicaría una clara aplicación potencial en el tratamiento de tumores hormono-dependientes en mujeres postmenopáusicas. En el presente proyecto, se plantea corroborar la actividad antitumoral del nanoconjugado de combinación HPMA copolimero-AGM-Dox utilizando modelos in vivo, así como elucidar las bases moleculares responsables de su destacada actividad anticancerígena. La comprensión del mecanismo de acción molecular nos permitirá el diseño futuro de nanoconjugados de combinación con propiedades mejoradas. En una segunda etapa se propone mejorar el valor terapéutico de esta nueva terapia de combinación mediante la utilización de un polímero biodegradable como portador, ácido poli-L-glutámico (PGA), desarrollando un nuevo conjugado de combinación PGA-AGM-Dox y evaluando su actividad antitumoral en modelos in vitro e in vivo. La etapa final de la presente tesis doctoral consiste en el desarrollo de un cribado farmacológico utilizando 5 quimio agentes y 3 agentes de terapia hormonal para evaluar su actividad citotóxica en las líneas celulares de cáncer de mama con el objetivo de seleccionar una combinación sinérgica de fármacos con mayor potencial citotóxico que AGM-DOX, que sirva de base para el desarrollo de futuras terapias de combinación. 1.1. Antecedentes. Para comprobar la hipótesis de partida se desarrolló un conjugado modelo HPMA copolímero-AGM-Dox que transporta una combinación de terapia endocrina (inhibidor de aromatasa (AGM) y quimioterapia (Dox) para el tratamiento de cáncer de mama (figura 1.) (Greco, et al., 2005; Vicent et al., 2005; Greco et al., 2006). Su diseño se basó en dos observaciones principalmente: (i) el copolímero HPMA copolímero-Dox (PK1, FCE28068) es un conjugado en fase clínica II con demostrada actividad en pacientes con tumores de mama quimioresistentes (Vasey et al., 1999) y (ii) los inhibidores de aromatasa pueden actuar de forma sinergíca con quimioterapia (Johnston and Dowsett, 2003). La elección de AGM (inhibidor de aromatasa de primera generación) se debió principalmente a que presenta una funcionalización adecuada para ser conjugado al polímero y está disponible comercialmente, por tanto, AGM fue considerado como el fármaco adecuado en esta primera fase de prueba de concepto (Goss and Strasser, 2001; Pool and Paridaens, 2007). Figura 1. Estructura del conjugado de combinación HPMA copolímero-AGM-Dox. El conjugado de combinación (HPMA copolímero-AGM-Dox) mostró un aumento muy marcado de citotoxicidad frente a modelos celulares de cáncer de mama positivos en receptores de estrógenos (ER+) (MCF7 y MCF7 Ca (transfectada de forma estable con el gen humano aromatasa (Yue et al., 1994)) en comparación a la actividad citotóxica obtenida con los conjugados individuales por separado (HPMA copolímero-Dox) o una mezcla simple de ambos (HPMA copolímero-Dox + HPMA copolímero-AGM) (Figura 2). Además, experimentos llevados a cabo con una familia de conjugados sintetizados que contienen AGM (los primeros conjugados con terapia endocrina descritos), confirmaron que era necesaria la liberación de AGM para conseguir la inhibición del enzima aromatasa (Greco et al., 2005; Greco et al., 2007). Figura 2. Comparación de la actividad citotoxica de HPMA copolímero-AGM-Dox y mezcla de conjugados simples en células MCF7 (Panel a) y en células MCF7 Ca (panel b). Dox; HPMA copolímero-AGM-Dox; HPMA copolímero-Dox + HPMA copolímero-AGM; HPMA copolímero-Dox. En una segunda fase se evaluó el mecanismo de acción de HPMA copolímero-Dox y HPMA copolímero-AGM-Dox para entender el efecto sinérgico de citotoxicidad únicamente observable cuando los dos fármacos se hallan covalentemente unidos a la misma matriz polimérica. En este sentido, se analizaron exhaustivamente las diferencias en el tráfico intracelular (unión e internalización celular, mecanismo de endocitosis con diferentes inhibidores de rutas endocíticas y fagocitosis) y en la cinética de liberación de fármaco (transporte lisosomotrópico) (Greco et al., 2005; Vicent et al., 2005; Greco et al., 2006). Figura 3. Perfil de liberación de Dox y AGM de los diferentes conjugados de HPMA en presencia de enzimas lisosomales de rata (tritosomas). Por otra parte, estudios preliminares de posibles diferencias en el mecanismo de acción molecular también se realizaron mediante técnicas de immunohistoquímica (Greco et al., 2007). Los resultados obtenidos sugieren que el aumento de actividad obtenido con el conjugado de combinación es debido principalmente a la diferente cinética de liberación intracelular de los fármacos (Figura 3). Al hallarse en la misma matriz polimérica poseen un perfil de liberación distinto en comparación a los conjugados simples, este cambio en la cinética de liberación induce un aumento de apoptosis celular en las células MCF7 y MCF7 Ca a través de la disminución de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 (Greco et al., 2007). De los datos obtenidos hasta ese momento, era evidente que el conjugado de combinación HPMA copolímero-AGM-Dox muestra un aumento en la actividad antitumoral in vitro y que mecanismos moleculares complejos parecen ser los responsables de este efecto sinergístico. Esta aproximación nos ofrece, claramente, una nueva oportunidad para el tratamiento de cáncer de mama metastático quimioresistente. Además de aumentar la actividad del citotóxico, esta plataforma tecnológica es de aplicación sistémica intravenosa (muy adecuada para el tratamiento de metástasis con elevada angiogénesis) y su mecanismo de internalización celular es diferente evitando mecanismos de resistencia como la sobreexpresión de la p-glicoproteína en membrana celular. En consecuencia, a la vista de los resultados preliminares obtenidos con HPMA copolimero-AGM-Dox como potente agente antitumoral en modelos in vitro, en este proyecto de tesis doctoral se pretende (i) completar el estudio del mecanismo de acción molecular del conjugado de combinación HPMA copolímero-AGM-Dox y evaluar su potencial terapéutico en modelos animales. De este modo podríamos definir el potencial antitumoral de esta terapia de combinación polimérica para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama. La especificidad tumoral debido al efecto EPR depende de la concentración en plasma del polímero circulante, de este modo, portadores poliméricos no-biodegradables tales como el copolímero HPMA o polietilenglicol (PEG) (Mw<40 000 g/mol para asegurar una eliminación renal efectiva), tienen un perfil farmacocinético menos favorable. Por este motivo, una vez demostrada la actividad in vivo del conjugado HPMA copolímero-AGM-Dox se propone (ii) mejorar el valor terapéutico de esta nueva terapia de combinación mediante la utilización de un polímero biodegradable como portador, ácido poli-L-glutámico y finalmente (iii) el desarrollo de un cribado farmacológico utilizando 5 quimio agentes y 3 agentes de terapia hormonal en las líneas celulares MCF7 y MDA-MB 321 con el objetivo de seleccionar una combinación sinérgica de fármacos con mayor potencial citotóxico, que sirva de base para el desarrollo de futuros polímeros de conjugados. 2. Metodología. 2.1. Síntesis de conjugados. 2.1.a. PGA-OSucc síntesis y purificación. Para la síntesis de PGA-AGM, se requiere la activación previa de los grupos carboxílicos. Debido a la pobre reactividad de la amina aromática AGM, una clásica activación de diimida no fue suficiente para el acoplamiento. Los grupos carboxílicos de PGA fueron activados primero por grupo succinimico. PGA (3,55 mmol, 471.4 mg) se disolvió en di-metil-formamida (DMF) anhidra (5 mL), los grupos succínicos (2,33 mmol, 268.4 mg) se añadió hasta alcanzar un máximo del 60% de la activación del grupo carboxílico. Cuando el medio de reacción era completamente transparente, N, N'-diisopropil carbodiimine (DIC) (2,33 mmol, 350 ¿L) y una cantidad catalítica de 4, dimetilaminopiridina (DMAP) fueron añadidos. La reacción se dejó durante 36 h. El DMF se evaporó por alto vacío y el PGA-OSucc se precipitó por Chloroformo (CHCl3) / acetona (4/1). El producto se purificó mediante lavado con éter (x3) en baño de ultrasonidos (5 min cada uno). El rendimiento fue de 77% y la tasa de activación fue de 41%. 2.1.b. PGA-AGM síntesis y purificación. PGA-OSucc (0,52 mmol, 91,3 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), a continuación, AGM (0,026 mmol, 6 mg) y una cantidad catalítica de DMAP fue añadida. El pH se controló y se ajustó con N, N-diisopropiletilamina (DIEA) a pH 8. La reacción se dejó reaccionar durante 36 h a temperatura ambiente (RT). El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado se precipitó con acetato de etilo (AcOEt) / acetona 4/1 a 4 ° C. PGA-AGM sal sódica se realizó mediante la adición de bicarbonato de sodio (NaHCO3) 1 M (0,58 mmol, 285 ¿L). La etapa de purificación por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se llevó a cabo con el fin de evitar el exceso de sal y el resto de productos que no habían reaccionado. Si una cantidad de DMAP libre se detectó por UV, una diálisis frente a H2O se realizó. Después de la liofilización, el rendimiento de la reacción fue del 60% (60 mg). 2.1.c. PGA-G-AGM síntesis y purificación. Para realizar PGA-G-AGM, se require la síntesis previa de G-AGM. G-AGM: Fluorenilmetiloxicarbonilo glicina (Fmoc-G) (0,65 mmol, 193,24 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL). La activación con DIC (0,975 mmol, 153 ¿L) se realizó durante 5 min y después se añadió el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0,975 mmol, 132 mg). Después de 10 minutos, AGM (0,65 mmol, 147 mg) fue finalmente añadido. El pH se controló y se ajustó a pH 8 con DIEA. La reacción se dejó reaccionar durante 36 h a temperatura ambiente. El DMF se evaporó a vacío elevado y Fmoc-G-AGM se purificó por extracción liq / liq. Fmoc-G-AGM se disolvió en AcOEt (10 mL) y se extrajo con NaHCO3 (3x10 mL). A continuación la fase orgánica se lavó con ácido clorhídrico (HCl) 1 M (3x10 mL), se secó sobre sulfato de sodio (Na2 (SO4)) y se evaporó para producir 90% de un producto blanco. La etapa de desprotección se realizó con piperidina al 20% en AcOEt durante 1 h. La purificación del producto se realizó por columna C18. Las condiciones cromatografías iniciales fueron: agua (H2O) / acetonitrilo (ACN) (30:70). La purificación se controló por TLC (G-AGM Rf: 0, Fmoc Rf: 0,83 con hexano: EtOAc 1:4). El protocolo de detección utilizizado fue doble: UV y tinción Nihindrina. El rendimiento de la reacción fue del 70% (0,46 mmol, 125 mg). PGA-G-AGM: La síntesis de PGA-G-AGM se realizó mediante el siguiente protocolo. PGA (0,51 mmol, 80,3 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), DIC (0,808 mmol, 126,2 µL) fue añadido y después de 5 min HOBt (0,808 mmol, 109 mg). Después de la activación de los grupos de ácido carboxílico por DIC y HOBt, G-AGM (0,0269 mmol, 7,8 mg) se añadió. El pH se controló y se ajustó a pH 8 con DIEA. La reacción se monitorizó por TLC y se dejó reaccionar 36 h a temperatura ambiente. El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado de fármaco se precipitó por CHCl3/Acetone 4/1 a 4 ° C con agitación media hora y media hora sin agitación. PGA-G-AGM sal de sodio se obtiene mediante la adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 ¿L). La etapa de purificación (Diálisis y columna G25) se llevó a cabo con el fin de evitar el exceso de sal y eliminar el fármaco libre. Después de la liofilización, el rendimiento de la reacción fue del 60%. 2.1.d. PGA-GG-AGM síntesis y purificación. En este caso, la síntesis previa de GG-AGM también era necesaria, sin embargo Fmoc-GG no estaba disponible comercialmente, por lo tanto Fmoc-GG se sintetizó en un paso anterior. Fmoc-GG: GG (0,28 mmol, 37,8 mg) se disolvió en una solución de NaHCO3 (10%) (1,6 mL), después se añadió dioxano (0,9 mL) y la reacción se enfrió en hielo. Una vez alcanzada la temperatura adecuada, cloruro de fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc-Cl) (0,28 mmol, 80 mg) fue cuidadosamente añadido gota a gota. La reacción se dejó reaccionar durante 4 horas en un baño de hielo y durante la noche a temperatura ambiente. Fmoc-GG se purificó por extracción liq / liq. La fase acuosa se extrajo con AcOEt (3x5 mL), a continuación seacidificó con HCl (1 M) hasta pH 2 y se extrajo con EtOAc (3x5 mL). La fase orgánica se recogió, se secó sobre Na2 (SO4) y se evaporó para producir 81% de un producto blanco. La síntesis GG-AGM y PGA-GG AGM-se llevaron a cabo siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente para G-AGM y PGA-G-AGM. 2.1.e. PGA-DOX síntesis y purificación. PGA (0,51 mmol, 80,3 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), a continuación, DIC (0,808 mmol, 126,2 µL) fue añadido y después de 5 min HOBt (0,808 mmol, 109 mg) se añadió también como sólido. Después de 10 min, Dox.HCl (0,0269 mmol, 14 mg) se añadió. El pH se controló y se ajustó a pH 8 con DIEA. La reacción se controló por TLC y se dejó reaccionar durante 36 h a temperatura ambiente (TA). DMF se evaporó mediante vacío elevado y el polímero conjugado de droga se precipitó usando CHCl3/Acetone 4 / solución de 1 hora a 4 ° C con agitación y media hora sin agitación media. PGA-Dox sal de sodio se obtuvo por adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 ¿L). La purificación se realizó del mismo modo que los conjugados PGA-X-AGM. 2.1.f. PGA-G-Dox síntesis y purificación. G-Dox: Bz-G (0,083 mmol, 31,8 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), a continuación se adicionó DIC (0,124 mmol, 20 ¿L) y después de 5 min HOBt (0,124 mmol, 22 mg) se añadió también como sólido. Después de 10 min de activación, Dox, HCl (0,083 mmol, 45,5 mg) fue finalmente incorporado. El pH se controló y se ajustó con DIEA para conseguir pH 8. La reacción se dejó reaccionar durante 36 h a TA. El DMF se evaporó a vacío elevado. El gránulo seco se disolvió en MeOH y la purificación se realizó por cromatografía RP-(C18) con 10 mL de 2-propanol/H2O (12:88) (v / v), 10 mL de 2-propanol/H2O (29 : 71) (v / v) y luego 20 mL de MeOH (pH 3,2). El procedimiento de purificación se controló por TLC a través de un sistema de detección de doble fijado en ¿ = 254 nm y ¿ = 366 nm. Entonces, la desprotección se llevó a cabo en H2 Pd / Cact durante la noche. La solución se filtró a través de celita y con un filtro de 0,2 micras. Después de la eliminación de MeOH, con un rendimiento de 50% fue alcanzada. PGA-G-Dox se sintetizó siguiendo el mismo procedimiento utilizado para PGA-Dox. 2.1.g. PGA-GG-Dox síntesis y purificación. La síntesis de GG-Dox y PGA-GG-Dox se llevaron a cabo siguiendo el protocolo descrito para el G-Dox y PGA-Dox, respectivamente. 2.1.h. síntesis y purificación de los conjugados de combinación. PGA-AGM-Dox:PGA-OS (0,259 mmol, 85,45 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL). Una cantidad catalítica de DMAP se añadió y el pH se ajustó a 8 con DIEA. A continuación se adicionó, AGM (0,027 mmol, 6.3mg). La reacción se controló por TLC y se dejó reaccionar durante 36 h a TA. Entonces se añadió DIC (0,036 mmol, 5,7 µL) y después de 5 min HOBt (0,036 mmol, 4.9 mg). Después de la activación de los grupos de ácido carboxílico por DIC y HOBt, se añadió a continuación Dox (0,024 mmol, 13,6 mg), se ajustó el pH a 8 con DIEA y la reacción se dejó reaccionar durante 36 h más a TA. El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado precipitó por adición de 5 mL de CHCl3: acetona (1:1). PGA-AGM-Dox sal sódica se obtuvo mediante la adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 ¿L). La purificación se realizó del mismo modo que los conjugados PGA-X-AGM. PGA-X-AGM-Y-Dox: El PGA se disolvió en DMF anhidro (5 mL). DIC (1,5 eq de X-AGM) se añadió y, después de 5 min el HOBt (1,5 eq de X-AGM). Siguiendo a la activación de los grupos ácido carboxílico mediante DIC y HOBt, se añadió X-AGM, el pH se ajustó a 8 con DIEA y la reacción se dejó reaccionar durante 36 h a TA. El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado precipitó por adición de 5 mL de CHCl3: acetona (1:1). PGA-X-AGM-Y-Dox sal sódica se obtuvo mediante la adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 ¿L). La purificación se realizó del mismo modo que los conjugados PGA-X-AGM. 2.2. Caracterización de los conjugados 2.2.a. Determinación de la carga de fármaco total y el contenido de fármaco libre en el conjugado sintetizado. X-AGM y AGM fueron utilizados como un estándar para producir una curva de calibración. Se disolvió en MeOH grado HPLC para tener una solución stock de 1 mg/mL. Este se diluyó entonces para producir una gama de concentración (0-65 µg/mL para AGM y 0-65 µg/mL de X-AGM). La absorbancia UV de cada muestra se determinó entre 200-400 nm. La otra posibilidad para evaluar la cantidad total de carga de fármaco consiste en la cuantificación del fármaco que no ha reaccionado. El primer paso fue realizar la curva de calibración de HPLC utilizando las soluciones añadidas para la curva de calibración UV. A continuación, el precipitado de AcOEt/acetona (4/1) obtenido después de la precipitación del polímero conjugado de fármaco, se evaporó, se disolvió en 10 mL de HPLC, y se inyectó en HPLC. La carga de fármaco se determinó de manera indirecta usando RP18 columna (125x4mm), con un flujo de 1mL/min y usando un gradiente de elución [A: H2O +0,1% TFA milliQ, disolvente B: ACN +0,1% TFA]. El tiempo total de análisis fue de 25 min y con el gradiente siguiente: t = 0 A 90%, t = 4 Un 90%, t = 19 A 10%, t = 21 A = 90%, t = 25 A = 90%, t = 40 A 0%, t = 42 A 0%. Un estándar interno (estradiol) se usó para la cuantificación del AGM. El tiempo de retención fue de 2 min para GG-AGM, 6 min para G-AGM y 5 min para AGM. Para evaluar la carga de fármaco libre, 100 µL de una concentración conocida de polímero conjugado de fármaco se añadió con 100 µL de bicarbonato sódico y 100uL de estradiol (1 µg/mL) como patrón interno. X-AGM libre y estradiol se extrajo a fondo con una mezcla de AcOEt / Isopropyl alcohol 4/1 (10s x 3). La capa orgánica superior se recuperó cuidadosamente y se secó a través de flujo de N2. El residuo seco se disolvió en 100 ¿L de grado HPLC ACN. En paralelo para construir una curva estándar, los mismos puntos utilizados para la determinación de la carga de fármaco total se utilizaron para hacer la curva HPLC estándar. 100 ¿L de cada punto se añadió a una mezcla de 100 ¿L de bicarbonato, 100¿L de estradiol y 700 ¿L de agua MilliQ y después se extrajo con AcOEt / alcohol isopropílico (4/1) como se ha descrito antes. La cantidad de fármaco libre se determinó por HPLC usando el mismo método descrito para la carga de fármaco no directa. El tiempo de retención fue de 2 para GG-AGM, 6 min para G-AGM, 5 min para AGM y 12 min para el estradiol. 2.2.b. Determinación de Dox total y libre por HPLC. Para determinar la carga de fármaco total de PGA-Y-Dox conjugado, 100 µL de una concentración conocida del polímero se añadió a una solución de ácido (1 mL de HCl 2 M). 100 µL de Dau (1 ¿g/mL) se utilizó como estándar interno. La solución se dejó 30 minutos a 80 ° C. Después de enfriar hasta TA, 360uL de 5M de NaOH se añadió para neutralizar el pH. Dox aglicona se extrajo con una mezcla de CHCl3/Isopropyl 4/1 (30 x 3). La capa acuosa superior se retiró cuidadosamente y la fase orgánica se secó usando flujo de N2. El residuo seco se disolvió en 100 µL de MeOH grado HPLC. En paralelo el mismo proceso se llevó a cabo con una mezcla de Y-Dox y daunorrubicina (DAU) para construir una curva estándar. Los estándares se disolvieron en 1 mL de MeOH grado HPLC para dar 100 µg/mL de solución madre de la que se preparó un intervalo de concentración (5-100 µg/mL). La cantidad de fármaco total liberado se determinó por HPLC utilizando columna RP18 (125x4 mm), con un flujo de 1mL/min y usando un gradiente de elución [A: 2-propanol/H2O 12:88 (v/v), disolvente B: 2-propanol/H2O 29:71 (v/v)] se ajustó a pH 3,2 con ácido fosfórico. Tiempo total fue de 25 min y el perfil del gradiente utilizado fue: t = 0% A 0, t = 1 A 60%, t = 3 A 60%, t = 8 A = 0%, t = 18 A = 0%, t = 20 Un 100%, t = 20 A 100%. Mediante detección por fluorescencia (¿ excitación = 485nm y ¿ emisión = 560 nm) se supervisaron los estándares internos Dox y Dau. El tiempo de retención (tr) fue de 15 min para aglicona Dox y 20 min para aglicona Dau. Para evaluar la carga de fármaco libre, 100 µL de una concentración conocida de conjugado se añadió a 100 µL de NaHCO3 y 100 µL de Dau (1 µg/mL) como patrón interno. La Dox libre y la Dau se extrajo con alcohol CHCl3/Isorpopyl 4/1 (30x3). La capa acuosa superior se retiró cuidadosamente y la fase orgánica se seco a través de flujo de N2. El residuo seco se disolvió en 100 µL de MeOH grado HPLC. En paralelo el mismo proceso también se llevó a cabo con una mezcla de Dox y Dau para construir una curva estándar. Los estándares se disolvieron en 1 mL de MeOH grado HPLC para tener una solución madre de 100 µg/mL de la cual se preparó un intervalo de concentración (0-65 µg/mL). La cantidad de fármaco libre se determinó por HPLC utilizando columna RP18 (125x4 mm), con un flujo de 1mL/min y usando un gradiente de elución [A: 2-propanol/H2O 12:88 (v/v), disolvente B: 2 -propanol/H2O 29:71 (v / v)], a continuación se ajustó a pH 3,2 con ácido fosfórico. El tiempo total fue de 42 min y el perfil de gradiente utilizado fue: t = 0% A 0, t = 1% A 0, t = 26 A 100%, t = 27 A = 50%, t = 37 A = 50%, t = 40 A = 0%, t = 42 A 0%. Para cuantificar la Dox y la Dau se utilizó la detección por fluorescencia El Tr fue de 20 min para Dox y 30 min para Dau. Para evaluar la carga de fármaco de manera indirecta se utilizó el mismo procedimiento que el desarrollado para PGA X AGM. 2.2.c. Peso Molecular (MW) determinación por GPC. Para evaluar la masa del conjugado, 100 ¿L de 3 mg/mL exactamente PGA-G-Dox solución se inyectó en GPC utilizando dos columnas TSK Gel en serie G2500 PWXL y PWXL G3000 con Viscoteck TDA detector 302 en serie con una detección UV. La fase móvil usando es PBS 0,1 M. 2.2.d. Small angle neautron scattering (SANS). Los experimentos de SANS se realizaron en el reactor HFR 57 MW (High-Flux Reactor) en el Instituto Max Von Laue-Paul Langevin (ILL) de Grenoble, Francia. Los conjugados se disolvieron a 10 mg/mL en D2O y los experimentos de dispersión se realizaron a 37 °C, condiciones que imitan la conformación en el cuerpo. Todos los experimentos se realizaron en células de cuarzo de 2 mm con la medición de tiempos de 1 h por muestra. 2.3. Estabilidad en plasma de conjugado y cinética de la liberación del fármaco en presencia de la catepsina B. 2.3.a. Cinética de liberación de fármaco en presencia de catepsina B. PGA-X-AGM, PGA-Y-Dox y PGA-X-AGM-Y-Dox (3 mg/mL) se incubaron (37 ° C) en una solución de acetato sódico (20 mM, pH 6), DTT (5 mM) y EDTA (2 mM). Para comenzar la degradación 5 unidades de catepsina B (100 ¿L) eran adicionadas. Alícuotas de los conjugados (150 ¿L) se tomaban de forma consecutiva en momentos seleccionados (0, 0,5, 1, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96 h) horas hasta dos semanas, y se congelaban inmediatamente en nitrógeno líquido hasta realizar el ensayo de HPLC. Para los experimentos control se reproducía el mismo ensayo pero sin conjugados. Una vez recopiladas las muestras, se descongelaron y se añadieron a tubos de polipropileno, completando hasta 1 mL con H2O incluyendo 100¿L de Dau (1 ¿g/mL) como patrón interno y 100 ¿L de tampón de formiato de amonio (pH 8,8), seguido por la adición de una mezcla de CHCl3: isopropanol 4 : 1 (5 mL). A continuación las muestras fueron extraídas a fondo con el vórtex (3x30s). La capa acuosa superior se retiró cuidadosamente y el disolvente se evaporó bajo N2. El residuo seco se disolvió en 100 ¿L de metanol para análisis por HPLC. La cantidad de liberación de fármaco de conjugados se determinó mediante HPLC utilizando el método descrito para el fármaco libre, y los metabolitos liberados fueron identificados por MALDI-TOF. En un volumen de 30 ¿L las muestras sin ningún tipo de preparación se inyectaron en GPC para seguir el perfil de degradación del polímero. 2.3.b. Estabilidad en plasma. Los conjugados (3 mg/mL) se incubaron a 37°C en suero recién extraído de ratones Balb/c hasta 24 h. En las horas programadas se recogieron alícuotas de 100 µL a los cuales se añadió 100 µL de MeOH con el fin de precipitar las proteínas del suero y recuperar el fármaco libre. Después de la centrifugación (12000 g, 5 min), los sobrenadantes se analizaron por HPLC como se informó anteriormente. 2.3.c. Identificación de metabolitos por MS. Los metabolitos X-AGM se identificaron utilizando un sistema UPLC-MS de Waters. El método fue optimizado masa capilar (kV) 3,50, el cono (V) 20, Extractor (V) 6, RF Lente (V) 0,2. La temperatura de la fuente era 120 ° C y la temperatura de desolvatación era de 380 ° C. Desolvatación Gas y el cono de gas eran respetablemente 950 y 50 L / H. El parámetro analizador y detector era lo normal para este tipo de masa ZQ. El método UPLC era 90/10 H2O + 0,1% de ácido fórmico / ACN ácido fórmico 0,1% a 10/90 H2O + 0,1 ácido fórmico / ACN ácido fórmico + 0,1% en 15 min. Las condiciones iniciales se recuperaron en 2 minutos y el sistema se equilibró en 4 min. Después de 20 µL de filtración de la muestra, se inyectó. Este sistema tenía una doble detección por UV (DAD), ¿ = 268 nm se utilizó en este caso y el TIC de masa. Para los metabolitos Y-Dox, el Pm es mayores, en consecuencia un experimento de MALDI-TOF se realizó. La matriz utilizada fue ¿-ciano-4-hydroxucinnamic ácido, se extrajo con un láser pulsado a 337 nm. La adquisición se realizo en modo reflectron. 2.4. Ensayos in vitro. 2.4.a. Cultivo celular. Para los ensayos in vitro las siguientes líneas celulares inmortalizadas fueron utilizadas: MCF7, MCF7 Ca, 4T1 (cáncer de mama metastásico de origen murino) y MDA-MB 231 (cáncer de mama humano ER-). La línea celular MCF7 Ca es el resultado de la transfección estable del gen de la aromatasa humana en MCF7 (cáncer de mama humano hormono dependiente). La línea MCF7 Ca fue generosamente proporcionada por la Universidad de Cardiff. Las células se cultivaron en placas P100 con el medio adecuado suplementado con suero bovino fetal (SBF) (10%) a 37 °C y 5% CO2. Para MCF7 Ca, el SBF utilizado fue previamente tratado con el fin de imitar las condiciones post-menopáusicas añadiendo una alícuota de estradiol a una concentración final de 10-9 M para el cultivo celular. En todos los casos, el medio celular se cambiaba cada dos días para inducir el crecimiento celular. Una vez alcanzada una confluencia celular de 70-90%, después de retirar el medio, y lavar las células con PBS, se añadía 1 mL de tripsina durante 5 min a 37 ºC, las células despegadas se recuperaban con 9 mL de medio libre y se centrifugaban durante 5 min a 200 g a TA. El sobrenadante se retiraba cuidadosamente y a continuación las células se resuspendían en medio fresco. Tras el recuento celular utilizando una cámara de Neubauer, las células fueron sembradas en placas de P100 a 40.000 cels/mL o a 20.000 cels/mL para alcanzar la confluencia después de una o dos semanas, respectivamente. 2.4.b. Preparación de SBF empobrecido en estrógeno. Con el fin de cultivar MCF7 Ca imitando las condiciones hormonales de mama en mujeres postmenopáusicas, el SBF fue previamente tratado para eliminar la mayoría de los factores de crecimiento y hormonas de origen y posteriormente se adicionó un nivel de hormona control al medio final. Para ello, el SBF (500 mL) se desactivó a 56°C durante 30 min. Una vez a temperatura ambiente, se ajustó a pH 4,2 con HCl (5 M) y se equilibró a 4 °C. A continuación una suspensión de carbón (25 mL) preparada añadiendo 18 mL de H2O dd, 0,2 g de carbón Norit A y 0,01 g de dextrano 80.000 era añadida al SBF frío durante16 horas a 4 °C. Posteriormente se centrifugó (40 min a 12.000 g) y por filtración gruesa se separó el carbón vegetal. El pH se reajustó a 7,2 con NaOH (5 M) y el SBF obtenido era esterilizado por filtración con filtros Millipore de 0,2 micras y alicuotado en recipientes universales a -20°C. Finalmente, para el cultivo de células MCF7 Ca, una alícuota de estradiol (concentración final 10-9 M) se adicionó al medio de cultivo conteniendo 10% de SBF pretratado. 2.4.c. Ensayo de MTS para la determinación de la viabilidad celular. Para poder realizar ensayos de viabilidad celular, en primer lugar se realizó una curva de crecimiento para todas las líneas celulares de cáncer de mama utilizadas. Las concentraciones de siembra celular óptimas para los ensayos de citotoxicidad fueron determinadas. 50 ¿L de las concentraciones seleccionadas de MCF7 Ca (4000cels/pocillo), 4T1 (2000 cels/pocillo) y MDA MB 231 (10000 cels/pocillo) se sembraron en placas transparentes de 96 pocillos (P96). Transcurridas 24 h en el caso de MCF7 Ca y 4T1cells y 48 h para MDA MB231, se adicionaron a los cultivos celulares diluciones seriadas de los conjugados poliméricos o compuestos libres (50 ¿L) (n = 6) y se incubaron durante 72 h a 37ºC y 5% de CO2 con el fin de evaluar los posibles efectos citotóxicos. Las células control fueron tratadas idénticamente, añadiendo medio sin compuestos. La viabilidad celular se determinó procediendo posteriormente al ensayo colorimétrico del MTS [3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5 - (3-carboximetoxifenil) -2 - (4-sulfopheyl) 2H-tetrazolio], siguiendo instrucciones del fabricante (Cell Titer 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Technical Bulletin TB169, Promega Corporation). 10 ul de solución de MTS se añadió a cada pocillo, y las células se incubaron durante otras 2 h a 37°C, CO2 5%. Las células vivas y metabólicamente activas son capaces de reducir el MTS a formazano, un producto soluble en el medio de cultivo, la absorbancia del formazano puede medirse a 490 nm y es directamente proporcional al número de células vivas en el cultivo. El efecto citotóxico se obtiene al comparar directamente el resultado obtenido en las células no tratadas (control) frente a las células tratadas con los compuestos. El mismo sistema de determinación de viabilidad celular fue utilizado para el desarrollo de la plataforma de cribado (HTPS). Sin embargo, en este caso las líneas celulares MCF7 y MDA MB 231 se cultivaron con antibiótico P/S (1%), con el fin de evitar cualquier posible contaminación durante la utilización del robot TECAN (condiciones no estériles controladas), imprescindible para la dispensación de los compuestos y sus combinaciones en las placas de 96 pocillos. 2.5. Ensayos in vivo. 2.5.a. Modelo de tumor en ratones atímicos con células MCF7 Ca. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por el Consejo de las Comunidades Europeas (86/609/ECC) y por el Real Decreto Español 1201/2005. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional. Ratones atímicos hembra Balb/c de 4-6 semanas de edad se adquirieron de Harlan (Europa). Los animales fueron alojados en un entorno libre de patógenos bajo condiciones de control. La ovariectomía se realizó bajo sevofluorano 1 semana antes de la inoculación de células. Las células MCF7 Ca se resuspendieron en matrigel y 10 millones de células en una alícuota de 100 ¿L se inyectaron en cada animal, en la tercera mama. Comenzando un día después de la inoculación de células, los animales recibían 100 ¿L de androstenodiona subcutánea (0,1 mg/ratón/día). La evolución del crecimiento tumoral se supervisaba dos veces a la semana midiendo el volumen del tumor con un calibrador para calcular el tamaño de los tumores. En el momento en que los tumores alcanzaban el tamaño máximo autorizado, los ratones se sacrificaban y el tumor era extirpado para realizar estudios histológicos y de vascularización. Posteriormente al proceso de optimización del modelo in vivo, los conjugados de polímero se ensayaron con el fin de evaluarse su actividad antitumoral. Por tanto, 10 millones de células MCF7 Ca fueron inyectados en la tercera mama. Una vez que el tamaño del tumor alcanzaba 0,2 cm3, los conjugados se inyectaban por vía intravenosa 3 veces cada 3 días y el peso del animal y el tamaño del tumor eran evaluados dos veces a la semana. Cuando el tumor alcanzó el tamaño máximo autorizado, corazón, hígado, riñón y bazo se extrajeron, se pesaron y se fijaron para continuar con análisis histológicos. En paralelo, los tumores fueron congelados en hielo seco para el análisis de expresión de proteínas mediante western blot. 2.5.b. Modelo de tumor inducido por células 4T1. Ratones hembra Balb/c de 4-6 semanas fueron comprados en Harlan Inc. (Europa). Los animales fueron alojados en un entorno libre de patógenos bajo condiciones de control. Dos concentraciones diferentes de células 4T1 (5x105 y 106 células) fueron inyectadas en la tercera mama. El crecimiento del tumor se siguió cada día. Una vez que el tamaño límite del tumor era alcanzado (1cm3), los ratones se sacrificaban y los órganos principales y el tumor se extraían con el fin de realizar estudios histológicos y vascularización. En una segunda etapa, con el fin de testar la actividad antitumoral de los conjugados de polímero en el modelo murino 4T1, 5x105 células fueron inyectadas en la tercera mama. Transcurridos 8 días el tamaño del tumor alcanzó 0,1 cm3 y a continuación los conjugados se inyectaban por vía intravenosa 3 veces cada 3 días y el peso de los animales así como el tamaño del tumor se evaluó cada día. Cuando el tumor alcanzó el tamaño máximo autorizado 1 cm3, corazón, hígado, riñón y bazo se extrajeron, pesaron y se fijaron para realizar estudios histológicos y el tumor fue congelado para el análisis de expresión proteica mediante western blot. 2.5.c. Análisis de la vascularización del tumor. Los tumores desarrollados en ambos modelos in vivo se retiraron y se analizaron para evaluar la vascularización y el poder de penetración de nuestros compuestos. Diferentes tamaños de tumor se desarrollaron en 10 ratones y cuando el tamaño del tumor alcanzó de 0,1 a 0,5 cm3, una solución de BSA-azul de Evans se inyectó por vía intravenosa. Una hora después de la inyección, los ratones se sacrificaron y el tumor, así como varios órganos se extrajeron. El tumor fue puesto en 1 mL de formamida durante 48 h a 60 °C con el fin de extraer el azul de Evans. La cuantificación se realizaba entonces en UV a 620 nm. 2.5.d. Análisis toxicológico: Evaluación hepática en sangre. La sangre extraída de corazón se centrifugó a 4000 g durante 10 minutos para obtener el plasma. El plasma fue enviado a Analitica Clínica Veterinaria Lab (ACVLAB) para evaluar las características de las diferentes enzimas implicadas en el daño hepático como transaminasa glutámico oxalacética (GOT), transaminasa glutámico piruvato (GPT), lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfatasa alcalina (ALP). 2.5.e. Análisis histológico. El tumor fue retirado de los animales control después de la optimización de ambos modelos in vivo. A continuación los tumores se lavaron en PBS y se fijaron en paraformaldehído (PFA) durante una noche. El exceso de PFA se eliminó por lavado con PBS a través de una fuerte de agitación (200 rpm) durante 20 min 3 veces. Finalmente, las muestras se almacenaron en una solución de PBS con 0,05% de azida sódica. Con el fin de incluir las muestra en parafina, una deshidratación previa de las muestras a través de 2 min de incubación en baños de alcohol de concentración creciente (30%, 50%, 70%, 96% y 2 baños de 100%) se llevó a cabo, seguido por 2 lavados en xileno de 1 min para incluir finalmente la muestra en parafina. A continuación, el bloque de parafina se redujo a un grosor de 4 micras y se instaló en Superfrost Plus portaobjetos de vidrio para proceder a la tinción hematoxilina-eosina. La hematoxilina tiene un profundo color azul-morado y tiñe los ácidos nucleídos de las células mediante una reacción compleja. La eosina es de color rosa y tiñe las proteínas forma no específica. En un tejido típico, los núcleos están teñidos en azul, mientras que el citoplasma y la matriz extracelular tienen diferentes grados de tinción de color rosa. Para la tinción de hematoxilina-eosina, en primer lugar los cortes de 4 micras se desparafinaron con xileno y posteriormente las muestras se rehidrataron con una batería de etanoles decreciente (100%, 95%, 70%, 50%, 30%, agua destilada). A continuación se sumergieron en 2 baños de agua de 5 min seguido de baño de hematoxilina 2 min y 2 lavados de agua de 5 min. Posteriormente los portaobjetos se incubaron 3 min en carbonato de litio y HCl al 0,25% en etanol al 70% para eliminar el exceso de tinción hematoxilina. Después de 2 lavados en agua durante 5 min, los cortes se incubaban en un solución fresca de eosina-floxina (0,35% de eosina, 1,1% de floxin a 2%, 83 mL de alcohol absoluto, 3,3 mL de agua destilada y ácido acético 450 ¿L) durante 6 min. Para finalizar, los cortes se lavaron hasta eliminar los restos de tinción y se deshidrataron de nuevo con diferentes baños en alcohol de graduación creciente. Tras el baño con etanol absoluto, los cortes se lavan con xileno y se montan con el medio de montaje no acuoso Eukitt. 2.5.f. Inmunodetección por Western blot. Las proteínas contenidas en los tumores extraídos de los ratones después de 16 días de tratamiento en el modelo 4T1 se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (dodecilsulfato sódico). De este modo las bandas de proteína obtenidas según su peso molecular eran posteriormente transferidas a membranas que permiten su inmunodetección. Para ello, los tumores extraídos se homogeneizaron en tampón RIPA (150 mM NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, 50 mM Tris PH8, 50 mM NaF, 100¿M Na3VO4 y la tableta de cóctel inhibidor de la proteasa), seguido de 15 min en agitación a 4 °C, una serie de tres sonicaciónes 5 s y 1 h a 4 °C en agitación. A continuación, la solución obtenida se centrifugó durante 20 min a 13.500 g, 4 ºC y los niveles de proteína contenida en el sobrenadante se determinaron mediante el ensayo de Bradford. 100 µg de proteína se mezclaron con tampón de muestra desnaturalizante 5xSDS y se hirvió durante siete minutos a 95 °C. Dependiendo del peso molecular de la proteína que se requiere analizar, se seleccionaba un porcentaje u otro de acrilamida, en este caso las proteínas se separaron a través de geles de 8% a 15% SDS-PAGE. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, UK). Posteriormente las membranas se bloquearon en 5% de leche desnatada durante 2 h, y se incubaron durante la noche a 4 ºC con los siguientes anticuerpos primarios: beta-actina y ¿-tubulina (Sigma), bax, (Santa Cruz Biotechnology), caspasa 3, Beclin-1, LC3B, pAKT, Bcl2 y VEGF (Cell Signaling), iNOS (Cayman Chemical) y HIF1¿ (BD Biosciences Pharmingen). El exceso de anticuerpos se retiró por lavado de las membranas en PBS/0,1% de Tween 20. Seguidamente las membranas se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios específicos para el primario a detectar y marcados con peroxidasa (cabra anti-IgG de ratón, asno anti-IgG de conejo y conejo anti IgG de cabra) (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). Después de 3 lavados en PBS/0,1% de Tween 20, la inmunodetección se realizó mediante el sistema de detección por quimioluminiscencia intensificada ECL Western Blot (Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles relativos de proteína se cuantificaron por densitometría con el programa Scion Image. Los resultados fueron normalizados utilizando ß-actina como referencia. 2.5.g. Análisis estadístico. Los resultados procedentes de ensayos in vitro han sido expresados como media ± SD (n = 4). Los resultados obtenidos de cada experiencia in vivo han sido expresados como media ± SEM (n = 3). El análisis estadístico se ha realizado mediante el programa informático GraphPad Prism 5. Los valores obtenidos de las experiencias se analizaron empleando ANOVA simple y el método de la t de Dunnett para comparaciones múltiples. Este método permite comparar los valores medios obtenidos para varios grupos problema respecto a un único grupo control en un mismo experimento, teniendo en cuenta el error asociado a las comparaciones múltiples (Dunnett, 1964). La significatividad respecto a la diferencia entre los grupos tratados y el control es (*) cuando el valor de t obtenido es mayor que el tabulado para un margen de confianza del 95% (p ¿ 0,05), (**) cuando es mayor del 99% (p ¿ 0,01) y (***) cuando es mayor del 99,9% ( p ¿ 0,001). No empleamos símbolo indicativo cuando la diferencia respecto al grupo control no es significativa. 3. Conclusión. - Dos modelos in vivo de cáncer de mama han sido establecidos, optimizados y caracterizados a partir de dos líneas celulares inmortalizadas, MCF7 Ca humanas y 4T1 murinas. - La prueba de concepto de sinergismo ha sido demostrada con HPMA copolímero-AGM-Dox, mostrando una diferencia significativa en la inhibición del crecimiento del tumor en comparación con Dox, HPMA copolímero-Dox o la combinación HPMA copolímero-AGM + HPMA copolímero-Dox. Ambos conjugados han ejercido una disminución importante del volumen tumoral en comparación con Dox en el modelo in vivo inducido utilizando la células humanas MCF7 Ca. - Se han establecido diferencias en el mecanismo molecular responsable del efecto antitumoral obtenido con ambos conjugados HPMA copolímero-AGM-Dox y HPMA copolímero-Dox. HPMA copolímero-AGM-Dox indujo una inhibición significativa de las proteínas involucradas en angiogenesis (VEGF) desde el segundo dia después de la última inyección, en comparación con HPMA copolímero-Dox y el control. Por lo tanto, HPMA copolímero-AGM-Dox presentaba un efecto inhibidor tumoral temprano en comparación con HPMA copolímero-Dox. Este mecanismo se completa a largo plazo con la inducción de autofagia por HPMA copolímero-AGM-Dox frente al efecto apoptótico generado por HPMA copolímero-Dox. - Una plataforma de combinación mas revelante para una aplicación clínica crónica ha sido desarollada utilizando PGA como portador. Tres familias PGA-X-AGM, PGA-Y-Dox y PGA-X-AGM-Y-Dox han sido sintetizadas, caracterizadas y evaluadas en cultivo celular. -Una relación directa entre la conformación en solución y la actividad in vitro ha sido demonstrada por los conjugados PGA de combinación. - El mejor candidato, PGA-(G-AGM)5mol% - (Dox)5mol%, fue seleccionado para su evaluación in vivo y mostró un retraso significativo en el crecimiento tumoral en el modelo de ratón 4T1, 10 días después de la primera inyección en comparación con los otros grupos. - Nuevos candidatos (quimioterapia + terapia endocrina 2ª generación) han sido evaluados in vitro a través de una plataforma de cribado con el objetivo de identificar una combinación de fármacos con mayor efecto sinérgico. Esto permitirá sintetizar conjugados de combinación con mayor eficacia en etapas posteriores. La mejor combinación encontrada ha sido (PTX, 4-OHT) en la relación (1,15:1). 4. Bibliografia. Goss, P.E. and Strasser K.(2001). 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