Tesis doctorales: TESEO

Ayuda Salir

Ficha de Tesis

Imprimir

Ministerio de Educación, Cultura y Deporte - Gobierno de España

Título: ESTRATÈGIES CROMATOGRÀFIQUES I QUIMIOMÈTRIQUES PER A ESTUDIS DE METABOLÒMICA NO DIRIGIDA EN ARRÒS (ORYZA SATIVA L.)
Autor: Navarro Reig, Meritxell
Universidad: Universidad de Barcelona
Departamento: Enginyeria química i química analítica
Fecha de Lectura: 07/05/2018
Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Analítica y Medio Ambiente por la Universidad de Barcelona
Dirección:
- TAULER FERRÉ, ROMÀ (Director)
- JAUMOT SOLER, JOAQUIM (Director)
- HERNÁNDEZ CASSOU, SANTIAGO (Tutor/Ponente)
Tribunal:
- CASAS BRUGULAT, JOSEFINA (presidente)
- NUÑEZ BURCIO, OSCAR (secretario)
- Checa Gómez, Antonio (vocal)
Descriptores:
- ANALISIS CROMATOGRAFICO
- ESPECTROSCOPIA DE MASAS
- PROCESOS METABOLICOS
- ANALISIS MULTIVARIANTE
Marcador: https://www.educacion.gob.es/teseo/mostrarRef.do?ref=1637439Añadir a favoritos.
Resumen:
Les mostres analitzades en els estudis de metabolòmica ambiental presenten una elevada complexitat per la gran quantitat d’informació bioquímica que contenen, especialment, en el cas d’estudis no dirigits. En aquests estudis és necessari l’ús de tècniques analítiques d’alt rendiment com, per exemple, la cromatografia de líquids acoblada a espectrometria de masses (LC-MS), les quals permeten analitzar els canvis en la concentració dels metabòlits en diferents tipus de mostres. D’aquesta forma es generen grans conjunts de dades multivariants (amb desenes de mostres i milers de variables), els quals requereixen l’aplicació d’eines quimiomètriques d’anàlisi de dades per tal d’extreure la informació d’interès. En aquesta Tesi s’han desenvolupat i aplicat nous mètodes d’anàlisi basats en tècniques de cromatografia de líquids uni- i bidimensional acoblada a espectrometria de masses, conjuntament amb noves estratègies d’anàlisi multivariant de dades que permeten extreure la màxima informació bioquímica en estudis de metabolòmica no dirigida d’organismes vegetals. En un estudi metabolòmic no dirigit, els reptes analítics i quimiomètrics més importants són: l’anàlisi instrumental exhaustiva del màxim nombre de metabòlits presents a les mostres, l’anàlisi quimiomètrica de les dades experimentals generades i la identificació i quantificació dels metabòlits resolts, especialment d’aquells que mostren canvis importants en la seva concentració degut a l’estímul o estrès aplicat sobre les mostres analitzades. En aquesta Tesi s’han avaluat i proposat diverses estratègies i eines que poden resultar útils per solucionar els reptes existents en aquestes etapes. S’ha estudiat per exemple la influència que poden tenir diferents factors experimentals en la separació dels metabòlits mitjançant cromatografia d’interacció hidrofílica (HILIC) com ara el tipus de fase estacionària, el pH i la força iònica de la fase mòbil. Els resultats obtinguts han demostrat que els factors més importants són el tipus de fase estacionària HILIC i el pH de la fase mòbil. Concretament, en l’estudi dels diferents tipus de fase estacionària s’ha determinat que les fases amida i zwitteriònica són les que proporcionen millors resultats per a l’anàlisi de metabòlits polars. D’altra banda, s’han comparat dues estratègies de tractament de dades de metabolòmica no dirigida: l’estratègia de referència en el camp basada en la utilització del programa XCMS, i la que s’ha proposat en aquesta Tesi, que es basa en el mètode quimiomètric de resolució multivariant de corbes per mínims quadrats alternats (MCR-ALS). Els dos procediments han proporcionat resultats similars i, en conseqüència, tots dos resulten apropiats pel tractament de dades de metabolòmica no dirigida. Però cal destacar que el procediment basat en MCR-ALS és més robust ja que s’ha pogut aplicar a una varietat major de dades experimentals. S’ha proposat també l’ús de models de relació quantitativa estructura-retenció (QSRR) que han permès relacionar l’estructura dels metabòlits amb el seu temps de retenció observat experimentalment. Els resultats obtinguts demostren que l’aplicació de models QSRR pot ser una eina a considerar per a la identificació dels metabòlits, ja que redueix el nombre de possibles candidats i en facilita la seva confirmació. La complexitat de les mostres analitzades en els estudis metabolòmics sovint excedeix els límits de capacitat de pic aconseguits per la cromatografia de líquids unidimensional. Per aquest motiu, la cromatografia de líquids bidimensional exhaustiva (LC×LC) es presenta com una bona tècnica alternativa que permet ampliar la capacitat de separació de mescles molt complexes, com ara les d’extractes de metabòlits de mostres biològiques. S’ha avaluat l’estructura de les dades obtingudes a partir de l’aplicació de LC×LC-MS, i la seva possible modelització. Els resultats obtinguts han mostrat que, en general, el model de MCR-ALS bilineal és el més indicat per a l’anàlisi d’aquest tipus de dades. S’ha estudiat també el possible ús del procediment ROIMCR (compressió de les dades per cerca de regions d’interès [ROIs] seguida d’una resolució mitjançant MCR-ALS) per a estudis de metabolòmica no dirigida mitjançant de LC×LC-MS. Els resultats han mostrat que la combinació de les tècniques de separació multidimensional i dels mètodes quimiomètrics de resolució és adequada en estudis metabolòmics, ja que permet resoldre i identificar un nombre molt elevat de metabòlits i lípids en una sola anàlisi. Finalment, s’ha investigat la influència de diferents factors estressants ambientals sobre el metaboloma d’un organisme vegetal model com l’arròs (Oryza sativa L.). Els factors estressants ambientals estudiats han estat abiòtics, com ara, l’estrès hídric, l’augment de la temperatura i la presència de metalls pesants (Cd, Cu i As) contaminants al sòl. Els resultats obtinguts han demostrat que els tres factors ambientals avaluats afecten de forma significativa el metaboloma de l’arròs durant el seu creixement. Els espectres de masses resolts s’han utilitzat per a la identificació dels metabòlits i lípids de les mostres biològiques analitzades. La interpretació biològica dels canvis de concentració dels metabòlits i lípids identificats han demostrat que la contaminació per metalls pesants ocasiona una disminució del creixement i de l’activitat fotosintètica de la planta, i que s’indueix un mecanisme de desintoxicació que permet disminuir el dany cel·lular. S’ha demostrat també que els increments de temperatura i d’estrès hídric provoquen un reajustament important del grau d’insaturació dels lípids de les cèl·lules de l’arròs, el qual permet millorar de forma considerable la fluïdesa de les membranes cel·lulars. In environmental metabolomic studies, the analysed samples are highly complex due to the great amount of biochemical information contained therein, especially in the case of non-targeted studies. In these studies, it is necessary to use high-throughput analytical methodologies, such as liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS), which allow analysing the concentration changes of metabolites among different types of samples. Multivariate datasets (with dozens of samples and thousands of variables) are generated in order to retrieve the information of interest. These huge datasets required the application of chemometric tools during the data treatment. In this Thesis, new analytical methods based on mono- and two-dimensional liquid chromatography coupled with mass spectrometry, combined with new multivariate data analysis strategies, have been developed and applied to obtain the major biochemical information in non-targeted metabolomic studies of vegetal organisms. In a non-targeted metabolomic study, the most important analytical and chemometric challenges are: instrumental analysis of metabolites, chemometric analysis of the experimental generated data and identification of metabolites, especially of those that show significant changes in their concentration due to the stress applied to the analysed samples. In this Thesis, different tools and strategies that can help to overcome these challenges have been proposed and assessed. For instance, the influence of different experimental factors in the separation of metabolites by hydrophilic chromatographic interaction (HILIC), such as the type of stationary phase, the pH and the ionic strength of the mobile phase, has been studied. The obtained results have shown that the most important factors are the type of stationary phase and the pH of the mobile phase. Specifically, in the comparison of different stationary phases, the amide and zwitterionic phases have been determined to provide better results for the analysis of polar metabolites. On the other hand, two data treatment strategies for non-targeted metabolomics data have been compared: the approach based on the XCMS software (which is the standard strategy in the metabolomics field) and the approach based on the multivariate curve resolution by alternating least squares (MCR-ALS) method (which has been proposed in the presented Thesis). Both procedures have provided similar results, and consequently, both are appropriate for the treatment of non-targeted metabolomic data. The MCR-ALS based procedure is more robust since it has been applied to a greater variety of experimental data. Moreover, the use of quantitative structure-retention relationship (QSRR) models, which have been able to relate the structure of the metabolites with their experimentally observed retention time, has also been proposed. The obtained results showed that the applications of QSRR models can be a useful tool for the identification of metabolites since it reduces the number of possible candidates and facilitates their confirmation. The complexity of the samples analysed in metabolomics studies often exceed the limits of peak capacity achievable by one-dimensional liquid chromatography. For this reason, comprehensive two-dimensional liquid chromatography (LC×LC) appears as a good alternative that increases the separation capacities of highly complex samples, such as extracts of metabolites from biological samples. The structure of the data obtained from LC×LC-MS analysis and its possible modelling have been evaluated. The obtained results have shown that generally, the MCR-ALS bilinear model is the most suitable for the analysis of this type of data. The use of ROIMCR data treatment approach (data compression by the search of regions of interest [ROI] and data resolution using MCR-ALS) in non-targeted metabolomics studies using LC×LC-MS has been studied. Results have shown that the combination of multidimensional separation techniques and chemometric methods is properly adequate in non-targeted metabolomic studies, since it allows the resolution and identification of a great number of metabolites in a single analysis. Finally, the effect of different environmental stressors on the metabolome of a vegetal model organism such as rice (Oryza sativa L.) has been investigated. The studied environmental stressors have been abiotic, such as hydric stress, temperature alterations and heavy metal (Cd, Cu and As) pollution. The obtained results have demonstrated that the three evaluated environmental factors significantly alter the rice metabolome. The resolved mass spectra have been used to identify the lipids and metabolites contained in the analysed rice samples. The biological interpretation of concentration changes of the identified lipids and metabolites have shown on the one hand that heavy metal pollution causes a decrease in growth and photosynthetic activity of the plant, and also it induces a detoxification mechanism that reduces cell damage. On the other hand, it has also been demonstrated that increases in temperature and hydric stress causes an important readjustment of the unsaturation degree of lipids in rice cells, which improve the fluidity of cell membranes.

Imprimir

Modificar Consulta Nueva Consulta

versión 4.2