Tesis doctorales: TESEO

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Ministerio de Universidades - Gobierno de España

Título: ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA Β-FRUCTOFURANOSIDASA DE XANTHOPHYLLOMYCES DENDRORHOUS Y SU EMPLEO PARA LA PRODUCCIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS PREBIÓTICOS Y OTROS DERIVADOS FRUCTOSILADOS
Autor: Gimeno Pérez, María
Universidad: Universidad Autónoma de Madrid
Departamento: Biología molecular
Fecha de Lectura: 28/02/2019
Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
Dirección:
- FERNÁNDEZ LOBATO, MARÍA (DIRECTOR)
Tribunal:
- Hernáiz Gómez-Dégano, María Josefa (PRESIDENTE)
- Rodriguez , Miguel Angel (SECRETARIO)
- LINDE LOPEZ, MARÍA DOLORES (VOCAL)
Descriptores:
- BIOLOGIA MOLECULAR
- BIOQUIMICA
- CATALISIS
Marcador: https://www.educacion.gob.es/teseo/mostrarRef.do?ref=1753512Añadir a favoritos.
Resumen:
La β-fructofuranosidasa XdINV de la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es una proteína extracelular altamente glicosilada que cataliza la liberación de fructosas de sustratos como sacarosa y rafinosa. Además, XdINV sintetiza neo-fructooligosacáridos, compuestos en los que enlaces β(2-6) conectan unidades de fructosa a la glucosa de una sacarosa, interesantes en la industria alimentaria por sus características prebióticas. En este trabajo se desarrolló un efectivo sistema de expresión heteróloga basado en Pichia pastoris, que fue escalado a nivel de fermentador y permitió obtener grandes cantidades de proteína, denominada pXdINV, con características bioquímicas y sintéticas muy similares a las del productor natural. A su vez, el sistema desarrollado constituyó una gran herramienta para la fácil manipulación de la secuencia génica responsable de XdINV, que se usó con el objetivo de ahondar en el análisis estructural de la proteína mediante mutagénesis dirigida. El estudio por difracción de rayos X de los cristales proteicos obtenidos confirmó la estructura dimérica de XdINV, cuyos monómeros presentaban la arquitectura típica de la familia 32 de las glicosilhidrolasas. Sin embargo, la proteína mostró un inusual patrón de dimerización regido por la presencia de numerosos restos glucídicos unidos a residuos de asparaginas localizados en la interfase dimérica y una larga extensión del extremo C-terminal de la proteína, no observada en otras proteínas de la familia. La obtención de diferentes variantes mutagénicas de XdINV, así como la de diversos complejos cristalográficos con diferentes sustratos, permitió señalar la importancia del residuo Trp105 y el bucle flexible TIV en la actividad y especificidad enzimática de XdINV, así como identificar hasta 4 subsitios de reconocimiento de sustratos. Además, las características topológicas del centro activo de la proteína le permitieron albergar una gran cantidad de compuestos, siendo capaz de fructosilar diversos azúcares, polialcoholes y hasta algunos derivados fenólicos, de los cuales se purificaron e identificaron el trisacárido neoerlosa, obtenido por la modificación de maltosa, dos isómeros del hidroxitirosol fructosilado y la fructosil-hidroquinona. Por último, se plantearon diferentes estrategias de inmovilización de XdINV con el objetivo de aprovechar el gran potencial de esta enzima a nivel industrial. De entre ellas, el biocatalizador generado por atrapamiento en hidrogeles de polivinil alcohol mostró las mejores características en cuanto estabilidad operacional y formación de FOS.

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