Tesis doctorales: TESEO

Ayuda Salir

Ficha de Tesis

Imprimir

Ministerio de Universidades - Gobierno de España

Título: FRUCTOSA-1,6-BISFOSFATASA CLOROPLASTÍDICA Y CITOSÓLICA: IMPORTANCIA EN LA SÍNTESIS Y DISTRIBUCIÓN DE CARBOHIDRATOS EN PLANTAS
Autor: Rojas González, José Antonio
Universidad: Universidad de Granada
Departamento: Bioquímica y biología molecular I
Fecha de Lectura: 08/11/2019
Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Granada
Dirección:
- Sahrawy Barragán, MARIAM (DIRECTOR)
- Serrato Recio, Antonio Jesús (CODIRECTOR)
Tribunal:
- Carrasco Jimenez, Maria Paz (PRESIDENTE)
- TRAVERSO GUTIERREZ, JOSE ÁNGEL (SECRETARIO)
- Mercado Carmona, Jose Ángel (VOCAL)
- Romero Puertas, María C. (VOCAL)
- MÉRIDA BERLANGA, ÁNGEL (VOCAL)
Descriptores:
- FOTOSINTESIS
- METABOLISMO INTERMEDIARIO
- ALIMENTOS TRANSGENICOS
- BIOQUIMICA VEGETAL
Fichero de tesis:
ISBN: 9788413063744

https://digibug.ugr.es/bitstream/handle/10481/58142/57159.pdf?sequence=4&isAllowed=y

Marcador: https://www.educacion.gob.es/teseo/mostrarRef.do?ref=1827450Añadir a favoritos.
Resumen:
1. Introducción La fotosíntesis es el proceso de almacenaje de energía solar más relevante en la tierra y es la fuente de toda nuestra alimentación y de la mayoría de nuestros recursos energéticos. Las plantas al realizar la fotosíntesis, sostienen virtualmente toda la vida en el planeta tierra, proporcionando el oxígeno que respiramos y la comida que comemos; al formar la base de las cadenas alimenticias globales y proporcionarla mayoría de la energía actual que la humanidad necesita a través de las fuentes de energía fósiles. El proceso de la fotosíntesis en plantas está basado en una serie de reacciones que ocurren en el cloroplasto y comprende el cambio de agua a oxígeno (O2), protones y electrones y dióxido de carbono (CO2) a azúcares. El mecanismo completo de la fotosíntesis se compone de dos partes diferenciadas aunque conectadas entre si. Comienza la fase luminosa, en la que se produce la síntesis de ATP o fosforilación (adenosíntrifosfato) a la vez que se genera poder reductor NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato). Durante esta fase luminosa tiene lugar la fotolísis del agua generándose O2, protones (H+) y electrones (e¿). El NADPH y el ATP, proporcionan el poder reductor y la energía necesaria para fijar el CO2 atmosférico para la biosíntesis de carbohidratos. De entre ellos, la sacarosa y el almidón son los principales productos finales, y sus funciones son esenciales para el desarrollo de la planta (Geigenberger, 2011a). La tasa de fijación neta de CO2 determina la tasa de síntesis de almidón y sacarosa. El ciclo de reducción de carbono fotosintético (el ciclo de Calvin¿Benson) es responsable de la formación de estos carbohidratos después de la fijación y reducción del CO2 atmosférico, siendo los primeros metabolitos intermedios importantes los triosa¿fosfatos (TP). Por condensación, las TPs forman fructosa¿1, 6¿bisfosfato (F1,6BP) que se utiliza para sintetizar almidón en el cloroplasto y sacarosa en el citosol. La fructosa¿1,6¿bisfosfatasa (FBPasa) cataliza la descomposición de F1,6BP en fructosa¿6¿fosfato (F6P) y fosfato inorgánico (Pi) (Zimmermann et al., 1976). Esta reacción conlleva una liberación de energía elevada que la hace irreversible. Hasta el momento, se han descrito tres FBPasas en la célula vegetal, la enzima citosólica (cyFBP) que está implicada en la síntesis de sacarosa y la gluconeogénesis (Cséke y Buchanan, 1986) y otras dos isoformas cloroplásticas (cFBP1 y cFBP2) (Serrato et al. 2009b; Serrato et al., 2009a). La FBPasa cloroplástica (cFBP1; EC 3.1.3.11) es una enzima clave de la vía de Calvin¿Benson y participa en la regeneración de la ribulosa¿1,5¿bisfosfato (RuBP) y la vía de síntesis del almidón, mientras la isoforma citosólica (cyFBPasa) ocupa un lugar limitante en la síntesis de sacarosa, y está regulada por fructosa¿1,6¿bisfosfato (FBP) y adenosín monofosfato (AMP).En el cloroplasto, la isoformacFBPasa1 está involucrada en la formación de almidón y es activada por luz debido a un aumento del pH y concentración de Mg2+y por reducción de puentes disulfuro de su dominio redox vía tiorredoxinas (TRX) (Jacquot y col, 1995, 1997; Hermoso y col, 1996; Chen y Xu, 1996; Jaramillo y col, 1997; Chiadmi y col, 1999; Wangensteen y col, 2001; Cazalis y col, 2004). La segunda isoforma del cloroplasto, cFBP2(Serrato y col, 2009), no contiene en su secuencia el dominio redox y es resistente a la inactivación por H2O2. Se han llevado a cabo un considerable número de investigaciones para demostrar el papel clave de estas enzimas en el control de la biosíntesis y distribución de los carbohidratos en células vegetales. En los últimos años, mediante el uso de diversos enfoques transgénicos en diferentes especies de plantas, se han analizado las funciones del cloroplasto y las FBPasas citosólicas en este contexto, para entender el papel de cada una de las enzimas en el equilibrio del ratio almidón/sacarosa en plantas. Se ha demostrado que las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan cFBP1 de guisantes en antisentido disminuyen el nivel de transcripción endógena sin afectar al fenotipo pero provocando un aumento en el área de la hoja y el contenido en sacarosa y por tanto en el desarrollo de la planta (Sahrawy col, 2004). Anteriormente plantas de patata (Solanum tuberosum) y de tomate (Solanum lycopersicum) fueron genéticamente manipuladas para disminuir la expresión de cFBP1. Las plantas de patata que presentaban una disminución del 15% de la actividad de cFBP1 inducían una importante disminución de la fotosíntesis provocando una disminución en el contenido de almidón, y por tanto, de la concentración de glucosa, fructosa y sacarosa (Kobmanny col, 1994). La misma inhibición de cFBP1 en plantas de tomate mostraba cambios insignificantes en el contenido de carbohidratos, pero un menor tamaño en plantas de tomate. Lo cual sugiere un papel específico de la isoforma cloroplastídica en tejidos fotosintéticos (Obiadalla¿Aliy col, 2004). Una inhibición del 80% de la cFBP1 de patata en plantas de tabaco dio lugar a una fuerte inhibición de la fotosíntesis sin afectar el contenido en sacarosa ni el crecimiento de la planta (Zrennery col, 1996). Otros estudios revelaron que las plantas de Arabidopsis con la expresión de cyFBP disminuida provocaban una reducción de la fotosíntesis y la síntesis de sacarosa y a mayores índices de contenido de almidón (Sharkeyy col, 1992; Zrennery col, 1996; Strandy col, 2000). Analizando las tres isoformas de FBPasas en frutos desarrollados de fresa, donde la síntesis y acumulación de azúcar son particularmente importantes, Serrato y col. (2009) detectaron un aumento notable en la expresión de cyFBP al final de la maduración del fruto. Esta situación es compatible con el incremento del contenido de azúcares solubles mayoritarios en frutas. Por el contrario, la cFBP1 fotosintética estuvo presente en los pasos previos a la maduración de la planta, conectando su función con el proceso fotosintético. Cho y Yoo (2011) han observado que el gen FINS1 de Arabidopsis similar a cyFBP puede formar parte de las rutas de señalización por fructosa. Sin embargo, la investigación que usa la estrategia del antisentido ha dado lugar a una mayor confusión en relación a como los cambios en la expresión de la FBPasa afectan a la síntesis y distribución de la sacarosa y el almidón debido a que estos resultados dependieron de las especies de plantas genéticamente manipuladas, el nivel de represión o sobreexpresión del gen seleccionado (FBPasa cloroplástica y citosólica) (Sharkey et al., 1992; Strand et al., 2000; Zrenner et al., 1996) y el tejido (hoja) u órgano analizado (fruta o tubérculo) (Obiadalla¿Ali et al., 2004).Además los estudios sobre los papeles individuales sobre las isoformas de la FBPasa en la fotosíntesis de la planta son escasos. La mayoría de los datos informaron sobre la tasa de fotosíntesis, el contenido de almidón y sacarosa y fenotipos generales. La FPBasa cloroplastídica (cFBP1) cataliza la conversión de fructosa¿1,6¿bisfosfato (FBP) a fructosa¿6¿fosfato (F6P) y es una enzima clave en el metabolismo del carbono, esta actividad está modulada tanto por la reducción de enlaces disulfuro vía TRX como por cambios en el pH y la concentración de Mg2+ que resultan de la iluminación (Anderson y col, 1979; Buchanan y col, 1980). En el caso de las reacciones redox, la regulación redox juega un papel central en la adaptación del metabolismo plastídico a la luz. Las dos enzimas redox reguladoras del Ciclo de CalvinBenson, FBPasa y Rubiscoactivasa, mostraron en este estudio reducción retardada e incompleta en el doble mutante cuando se encontraba bajo los efectos de la luz, comparando con el tipo silvestre (Naranjo y col, 2016). Aparte de la ya conocida inhibición alostérica de cyFBPasa por F2,6BP y AMP (Daie, 1993), no existe otro mecanismo de activación/desactivación que haya sido descrito tan exhaustivamente. Diversos análisis realizados mediante Western blot comprobaron que no existía proteína en líneas transgénicas de tomate basadas en genes de patata, atribuyendo la actividad residual de la fruta a cyFBPasa. Los contenidos de almidón no diferían significativamente en comparación con el control. Las concentraciones de glucosa y fructosa aumentaron significativamente, al igual que el contenido en PGA al contrario que lo visionado en hojas de patata (Koßmann y col, 1994). Es de sobra conocido que las dos enzimas claves para la síntesis de sacarosa son cyFBPasa y SPS. Sharkey y col. (1992) sugieren que las plantas mutantes de cyFBPasa podrían sobrevivir gracias al hecho de emplear más carbono para almidón que para sacarosa durante el día y movilizar el exceso por la noche. En el caso de plantas de Flaverialinearis se ha visto como la actividad de cyFBPasa está controlada por un gen nuclear y muestra la existencia de coodominancia entre los dos alelos de las líneas correspondientes (Micallef y Sharkey, 1996). La determinación de la biomasa total y la asimilación de CO2apuntaban a una reducción de la actividad de esta enzima sobre el índice de crecimiento y la fotosíntesis (Micallef y col, 1996). El índice de la fijación de CO2 neto y la partición de los fotoasimilados determina el índice de la síntesis de almidón y sacarosa. De acuerdo con la regulación de la retroalimentación el almidón es sintetizado cuando el índice de fotosíntesis supera la capacidad de la hoja para exportar sacarosa (Cséke y col, 1984; Stitt y col, 2010). Sin embargo en estudios recientes han aparecido varios mecanismos reguladores nuevos que están involucrados en el control del ciclo diurno de la sacarosa y en el balance de almidón en plantas. La regulación redox (Ballicora y col, 1998; Ballicora y col, 2000; Tiessen y col, 2002; Michalska y col, 2009; De Dios BarajasLópez y col, 2012), la ruta de señalización T6P (Schluepmann y col, 2003; Kolbe y col, 2005; Wingler y col, 2012), o el control del reloj circadiano (Lu y col, 2005; Graf y col, 2010; Graf y Smith 2011; Yazdanbakhsh y col, 2011; Stitt y Zeeman 2012) son algunos de los mecanismos empleados por plantas para controlar el flujo de metabolitos procedentes del azúcar durante el desarrollo normal. Como Arabidopsis retiene sólo pequeñas cantidades de reserva de carbono al anochecer, se convierte en deficitaria en este sentido a las 2 horas cuando la fotosíntesis está temporalmente inhibida al principio del día. Cuando la planta está creciendo en fotoperiodos cortos, se exhibe un aborto de flores y semillas que se asocia con niveles bajos de C. El estrés abiótico que impacta sobre la fotosíntesis puede llevar a la carencia absoluta de C, especialmente, cuando por ejemplo existe una alta temperatura, que también está acompañada de un aumento de la respiración (Cookson y col, 2016). La sacarosa es el producto más abundante de la fotosíntesis y la forma mayoritaria de transporte del azúcar en plantas (Lunn y col, 2014). Además juega un papel crucial durante el crecimiento, el desarrollo, la transducción de señales y la aclimatación al estrés del medioambiente que afecta a las plantas. La ruta metabólica general de la sacarosa es la que sigue: las triosas fosfato que se producen en el cloroplasto a través del ciclo de Calvin son transportadas al citosol, a partir de las cuales la fructosa¿6fosfatoessintetizada. Los productos se usan para producir glucosa¿6P y glucosa¿1P mediante la fosfoglucoisomerasa y la fosfoglucomutasa respectivamente. La UDP¿glucosa pirofosforilasa es usada para catalizar transformación de glucosa¿1P en UDP glucosa, a partir de la cual la sacarosa¿6Pes producida por la sacarosa fosfato sintetasa (SPS). Finalmente, la sacarosa es sintetizada a partir desacarosa¿6P mediante la acción de la sacarosa fosfato fosfatasa (SPP). Por otro lado, la sacarosa también es degradada tanto por sacarosa sintetasa como por invertasa. En el primer caso se degrada a UDP¿glucosa que es una reacción reversible. En el segundo caso la sacarosa se transforma en fructosa y glucosa. La primera se emplea para sintetizar F6P por fructoquinasa y la última es fosforilada para dar lugar aG6P mediante la acción de la hexoquinasa (HK), una importante molécula señal. Como se puede comprobar, al menos 9 enzimas están involucradas en el metabolismo de la sacarosa (Jiang y col, 2015). El almidón es el principal almacén de carbohidratos en plantas. Es sintetizado por sintetasas de almidón (SS) usando ADP¿glucosa como la molécula donante de azúcar y enzimas de unión, este poliglucano se acumula en tejidos fotosintéticos y no fotosintéticos. En células mesofílicas de plantas, más del 50% del fotosintetizado se retiene en los cloroplastos durante el día en forma de almidón, el cual es movilizado de nuevo durante la noche para el apoyo del metabolismo y crecimiento no fotosintético. El almidón está hecho de dos fracciones de polisacáridos distintas que están ensambladas juntas para formar un gránulo de almidón semicristalino: amilosa y amilopectina. La amilosa es un polímero lineal de más de miles de residuos de glucosa, mientras que la amilopectina es un polímero aún mayor unido regularmente con ¿1¿6¿ puntos de enlace exhibiendo niveles jerárquicos de estructura arquitectónica específica cuya síntesis requiere las acciones altamente coordinadas de las enzimas que sintetizan el almidón, enzimas que se encargan de unir y separar (Baslam y col; 2017). En base a estos datos, el objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido aclarar la contribución de cada una de las fructosas¿1,6¿bisfosfatasa cloroplastídica y citosólica en la fotosíntesis, en el desarrollo de las plantas, el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno, en la síntesis y distribución de carbohidratos y perfiles metabólico en plantas en plantas de Arabidopsis. 2. Desarrollo La existencia de diferentes isoformas de FBPasa en plantas dificulta el poder predecir con precisión el papel metabólico de cada una de ellas. La pérdida de expresión de cyFBP no se vio reflejada en el fenotipo de cyfbp, parecido al de la línea silvestre, indicando que, en Arabidopsis, la biosíntesis de sacarosa sería posible gracias a las hexosas (HXs) o hexosas¿Pi (HXs¿Pi) exportadas del cloroplasto (Fettke et al., 2011), probablemente debido a la sobre¿activación de la biosíntesis de almidón. Una serie de resultados obtenidos con este mutante respaldarían esta hipótesis: (i) no hay ninguna compensación de la actividad FBPasa por parte de la fosfofructofosfatasa (PFP) existe una sobre¿acumulación de almidón y un mayor contenido en los productos de degradación de almidón; y se produce una mayor acumulación de transcrito del gen que codifica para el transportador de maltosa (MEX1), el translocador de glucosa del plastidio (pGlcT) y los translocadores de glucosa¿6¿Pi/Pi del plastidio (GPT1 y 2) (Cho et al., 2011). En la misma línea de resultados, la reducción de los niveles del translocador de triosas fosfato (TPs) en el mutante tpt¿2 de Arabidopsis, en el que se encontraría parcialmente bloqueada (mutante knock¿down) la salida de TP hacia el citosol, produce una mayor acumulación de almidón comparada con plantas silvestres, aunque manteniendo unos valores similares de sacarosa. La hipótesis de partida de este trabajo anticipaba un efecto deletéreo de la suma de las dos mutaciones fbp que afectan a las dos principales rutas gluconeogénicas en Arabidopsis. Sin embargo, sorprendentemente, el doble mutante cyfbp cfbp1 es viable, y muestra un fenotipo similar al de cfbp1. Experimentos de análisis de expresión revelaron solo una pequeña inducción de los niveles de transcrito del gen que codifica para la otra isoforma plastidial cFBP2 en la línea cyfbp cfbp1. No obstante, dado el pequeño incremento de la actividad FBPasa observado en este mutante, la contribución tanto de cFBP2 como de PFP parece ser muy limitada. El fenotipo clorótico de las hojas de cfbp1 y cyfbp cfbp1 claramente estaría indicando que la pérdida de cFBP1 condiciona tanto el potencial fotosintético como la producción de biomasa en ambos mutantes. Además, los resultados obtenidos con la fluorescencia de la clorofila, que apuntan a que el alelo mutante cfbp1 está afectando al PSII y al transporte de electrones fotosintético, estarían en línea con los datos mostrados por otros autores en el que mutante de pérdida de función para cFBP1 La fotosíntesis, además de conducir a la producción de NADPH y ATP necesarios para la fijación de CO2, tiene asociada invariablemente la producción de subproductos como las ROS, nocivas para la célula (Mittler et al., 2002). En los mutantes cfbp1 y cyfbp cfbp1, debido a los cambios importantes a nivel de PSII y del ciclo de Calvin¿Benson, la producción de ROS supera a la de la línea silvestre. Estas ROS se estarían produciendo porque el O2 estaría actuando como último aceptor de electrones de la fotosíntesis para dar lugar a O2¿¿, que se acumularía en los cloroplastos. Esta situación se confirmó por la clara inducción observada en CuZnSOD2 y FeSOD3 (Kliebensteinet al., 1998). Otra fuente de ROS es la enzima GOX, asociada a la fotorrespiración en los peroxisomas y que se encontró inducida en todos los mutantes FBPasa. La acumulación de H2O2 en estos orgánulos (producido por dismutación del O2¿¿) indujo la actividad de la enzima CAT, aunque esta no fue capaz de evitar el daño oxidativo ocasionado en los mutantes analizados. Los mayores productores de H2O2 en una célula fotosintética son el cloroplasto y el peroxisoma, aunque también existen otras fuentes de ROS como las NADPH oxidasas o la cadena de transporte electrónico mitocondrial. A pesar de que la actividad APX se encuentra inducida en el doble mutante FBPasa, el análisis mediante western blot indica que la 2¿Cys PRX plastidial no se encontraría sobre¿oxidada en los mutantes FBPasa, indicando que el cloroplasto no se encontraría bajo un elevado nivel de estrés oxidativo (Iglesias¿Baena et al., 2010). Asimismo, la pérdida de ambas isoformas, principalmente de cFBP1, provoca cambios en el metabolismo de las ROS y ajustes en la razón ascorbato/dehidroascorbato como mecanismo de destoxificación. La producción de grupos carbonilos afecta a las subunidades grande y pequeña de la RUBISCO, la RUBISCO activasa, la OCE3 del complejo de catálisis del H2O y a las proteínas de unión a clorofilas (Johansson et al., 2004). El completo análisis metabólico llevado a cabo mediante las técnicas GC¿TOF MS y de espectroscopía de fluorescencia proporciona una visión general de las alteraciones metabólicas en los mutantes de FBPasa, especialmente significativa en cfbp1 y cyfbp cfbp1, y que estarían detrás del exacerbado fenotipo que muestran. La inactivación de cyFBPconduce a una acumulación general de F1,6BP, HXs¿Pi y de TPs durante el periodo de luz y que haría que se produjera una mayor acumulación de almidón. Sin embargo, serán necesarios análisis metabólicos a nivel subcelular para confirmar esta hipótesis (Geigenbergeret al., 2011). Los niveles de la mayoría de los azúcares incrementaron, principalmente de maltosa e isomaltosa, los productos mayoritarios de la movilización del almidón en cloroplastos, mientras que los niveles de sacarosa se mantuvieron similares a los de la línea silvestre. En este sentido, Cho y colaboradores (2011) también demostraron que mutantes de Arabidopsis que han perdido la capacidad de exportar maltosa o glucosa desde el cloroplasto tienen muy reducidas sus capacidades fotosintéticas, menores niveles de sacarosa, sufren una reducción del metabolismo del almidón y presentan retraso en el crecimiento. La mutación cyfbp produjo un sensible incremento en el contenido de trehalosa. Algunos autores han propuesto que la trehalosa¿6¿fosfato, el intermediario de la biosíntesis de trehalosa, es un componente de la ruta de señalización que media la regulación de la acumulación y/o movilización del almidón acumulado transitoriamente en las hojas de Arabidopsis. En una asociación lógica de ideas, podríamos pensar que el incremento de la trehalosa estaría respondiendo a las nuevas demandas metabólicas derivadas de la sobre¿acumulación de almidón y de la inactivación de la ruta de biosíntesis citosólica de sacarosa (Martinset al., 2013). Los efectos positivos de la la trehalosa incluyen una disminución del daño foto¿oxidativo (Ba et al., 2005). En cuanto al metabolismo de los aminoácidos, no se observaron cambios en el mismo, acotando las diferencias observadas al metabolismo de los carbohidratos. 3. Conclusiones A. La ausencia de cpFBP1 afecta drásticamente el fenotipo de la planta, indicando un papel esencial en el desarrollo de la misma. B. El mayor número de estomas en el envés no implican mayor tasa fotosintética en los mutantes analizados. C. Un aporte de glucosa o sacarosa acelera el crecimiento del mutante cfbp1 igualándolo al del WT. D. La viabilidad del mutante cyfbp cfbp1 sugiere procesos alternativos para la supervivencia de la planta. E. El contenido de glucosa y sacarosa es mayor en cfbp1 a las 8 h y 16 h, respectivamente, y menor en la fase oscura. A mitad de la noche (20 h) en el mutante cyfbp se produce una mayor acumulación de sacarosa. F. Existe un incremento de peróxido de hidrógeno en todos los mutantes respecto al WT. Este incremento provoca un mayor daño en proteínas en todos los mutantes y una mayor peroxidación lipídica en el mutante cfbp1. G. La modificación del contenido de sacarosa y de almidón de forma controlada podría ser una herramienta biotecnológica interesante para los cultivos de interés agronómico.

Imprimir

Modificar Consulta Nueva Consulta

Versión 4.4